CIQTP 延长：在心源性猝死中的作用和机制 (IQARE-SCD)

心源性猝死（SCD）是发达国家的主要死亡原因。 据估计，法国每年有 40,000 至 50,000 人突然死亡。 这些死亡中的大多数涉及老年人，并且与冠状动脉疾病有关。 然而，估计法国每年有 4000 至 5000 名年龄在 1 至 45 岁之间的人突然死亡。 SCD 通常发生在没有可识别的 ECG 异常和结构缺陷的年轻患者中。 因此，年轻成人中的大多数 SCD 事件仍然无法解释，并被归类为难以捉摸的一组，称为特发性心室颤动 (IVF)。

研究人员最近发现了一种新的心律失常实体（儿茶酚胺诱导的 QT 延长；CIQTP），它会导致 SCD，其特征是静息时的 QT 持续时间正常，但在精神压力测试期间主要 QT 延长。 该转化项目的目的是确定这种罕见疾病新表型在不明原因的 SCD 中的患病率，并确定其潜在的病理生理机制。

精神压力测试的使用可以扩展到其他遗传性心律失常疾病，如长QT综合征。 鉴于识别新受影响亲属的可能性，它可能会导致家庭中心源性猝死复发的风险显着降低。

该项目的主要问题是描述这种导致 SCD 的新综合征的临床意义和病理生理机制。

根据我们最近对这种儿茶酚胺诱导的 QT 延长的描述，研究人员假设：

• 在完全家族筛查后，60% 的未确诊家族性 IVF 部分涉及该综合征7。 实际上，由于基线 ECG 在没有 MST 的情况下是正常的，因此可以通过先前被认为不受遗传性心律失常影响的先证者和亲属的精神压力测试来识别此类临床特征。
• 精神压力测试将有助于识别其他遗传性心律失常的边缘病例，例如长 QT 综合征。 事实上，这种遗传性心律失常的特征是在基线心电图上观察到基于遗传的 QT 间期延长，但超过三分之一的患者在基线时仅出现轻微的 QT 间期延长。 因此，他们需要使用激发测试（例如 运动试验和肾上腺素试验）以揭示病理性 QT 间期延长 18。 研究者假设 MST 可能有助于揭开这种 QT 延长的面纱。
• 根据研究者最近描述的这种疾病的常染色体遗传模式，研究者推测该综合征属于孟德尔疾病。 因此，研究人员建议应用基于家族的方法来识别与 CIQTP 综合征相关的主要基因。

该项目的范围是描述这种导致心源性猝死的新综合征的临床意义和病理生理机制。 更具体地说，研究人员旨在：

• 确定 CIQTP 在不明原因的 SCD 中的患病率并确定新的受影响的大家庭
• 确定精神压力在 QT 间期延长中的作用
• 结合大家族的全基因组测序和血统分析鉴定与疾病相关的基因
• 对来自 CIQTP 患者的诱导多能干细胞衍生心肌细胞 (iPSC-CM) 进行转录组学和电生理学分析，以确定推定的生物标志物和病理生理机制。

基于这种转化方法，研究人员旨在描述 CIQTP 在心源性猝死中的病理生理学和临床意义。 使用全基因组测序和 iPSC-CM 分析等创新方法描述这种新综合征可能会在不明原因的 SCD 领域取得全面而重大的进展。 除了识别和照顾新受影响的亲属外，它可能有助于定义基于遗传/病理生理学的治疗。

研究人员已经证明，MST 是检测这种新综合征的高效诊断工具，研究人员认为，它还可能有助于揭示沉默 LQTS 突变携带者的 QT 延长。 MST 具有应用快速和简单的优点。 因此，揭示无法解释的显示常染色体显性遗传的心脏电缺陷的家族隔离可能会很有趣。 它还可以减少 LQTS 中遇到的表观非外显率。

项目任务

任务 1：确定 CIQTP 在不明原因的 SCD 中的患病率并确定新的受影响家庭

大多数 45 岁之前的 SCD 病例仍然无法解释，很可能是由于遗传性心律失常疾病 6。 在发生不明原因的 SCD 后，转诊到南特、雷恩、图尔或布雷斯特大学医院的所有连续家庭都将纳入研究。

所有可用的临床先证者数据将从转诊医生和亲属处收集。 当进行尸检时，诊断可实现的先证者将被排除在研究之外。

家族筛查 45 岁前发生不明原因 SCD 后，对一级亲属进行家族筛查，若阳性则扩大至其他亲属。 当一级亲属无法进行筛查时，将在更远的亲属中进行。

临床筛查将包括回顾过去的病史、临床检查和基线心电图。 在第一组检查、压力测试、经胸超声心动图 (TTE)、使用阿马林 (1 mg/kg) 或氟卡尼 (2 mg/kg) 和肾上腺素测试 23 的钠通道阻滞剂激发试验 (SCBC) 后未做出诊断的情况下， 24将执行。 将额外进行精神压力测试，以揭示 QT 间期延长与正常基线 ECG 25。

精神压力测试协议（附录 2）MST 将按如下方式执行。 患者将被置于仰卧位，不解释测试过程。 心电图将在基线和测试期间永久记录。 然后根据患者的受教育程度（心算、地理或儿童迪斯尼角色名称）突然进行MST，要求正确、快速回答。 如果心率每分钟增加至少 20 次，则 MST 将被视为相关。 如果心率没有每分钟增加 20 次，则该测试将被视为不可解释，除非确定 QTc 显着延长。 MST 通常持续不到 2 分钟。 测试结束后 30 分钟将记录新的心电图，以尝试获得心率最低的心电图轨迹。

诊断

在基线、压力测试期间和药理测试期间进行的 ECG 将由两位对临床和遗传状况不知情的医生进行审查。 所有数据都将收集在一个核心数据库中。

诊断标准遵循最新共识会议的指南24、26。 研究人员还将考虑在肾上腺素或精神压力测试期间 delta QTm > 30 ms 和压力测试后 3 分钟的 delta QTc > 30 ms，足以诊断 LQTS 27,28。

每次测试之间至少间隔 30 分钟，以清除儿茶酚胺。 所有测试将在中断可能干扰测试的每种治疗后至少 5 天进行。

这项研究是根据欧洲临床和遗传研究指南进行的。 协议批准将从机构伦理委员会获得。 将从同意参与临床和遗传研究的每位患者处获得知情的书面同意书。

统计分析 将使用 Social Science® 软件（IBM Corp.，Armonk，New York）进行统计分析。 分类变量将以其数量和百分比显示。 卡方检验或 Fisher 精确检验（基于预期频率）将用于比较组间的分类变量。

定量变量将以均值±标准差或中位数（第 25 位；第 75 位）表示。 将使用基于分布的 t 检验或 Mann Whitney 检验对连续变量进行分析。 家庭之间的比较将使用家庭内平均值或连续变量的中位数进行，以限制对家庭规模的偏差。 小于 0.05 的双边 P 值将被视为表示所有测试中的统计显着性。

任务 2：确定精神压力在 QT 间期延长中的作用

为了确定精神压力在 QT 延长中的作用，研究人员将在南特、雷恩、图尔或布雷斯特大学医院额外招募阳性和阴性对照组。

这将包括在基线时没有 QT 延长的受长 QT 综合征影响的家庭的连续亲属的登记。 该测试的结果将与使用运动测试和肾上腺素测试的常规筛查进行比较。 因此，研究人员的目标是招募进一步定义为主要遗传型长 QT 综合征（LQT1、LQT2 和 LQT3，阳性对照组）携带者的患者。

研究人员将另外招募一个阴性对照组，由健康基线心电图正常、无心脏结构异常且未服用任何可能干扰 MST 的药物的健康患者组成。 该人群将包括不明原因 SCD 筛查呈阴性的家庭的亲属。

诊断标准和测试协议将与任务 1 中定义的相同。

每次测量将使用三个连续的节拍，并且将考虑两位研究者获得的平均值。 QT 间期将在 DII 或 V5 中测量，从 QRS 复合波开始到 T 波结束（定义为 T 波切线与等电位线的交点）。 U 波将从 QT 间期的测量中排除。

这项研究是根据欧洲临床和遗传研究指南进行的。 协议批准将从机构伦理委员会获得。 将从每位同意参与临床和遗传研究的患者处获得书面知情同意书。

将使用 Social Science® 软件（IBM Corp., Armonk, New York）进行统计分析。 将在基线和两次测试（精神压力测试、运动测试、肾上腺素测试）期间对每个临床和 ECG 参数进行组间比较。 分类变量将以其数量和百分比显示。 卡方检验或 Fisher 精确检验（基于预期频率）将用于比较组间的分类变量。 定量变量将以均值±标准差或中位数（第 25 位；第 75 位）表示。 将使用基于分布的 t 检验或 Mann Whitney 检验对连续变量进行分析。 小于 0.05 的双边 P 值将被视为表示所有测试中的统计显着性。

研究人员已经在南特医院招募了 30 名健康对照者和 25 名患有 LQTS（LQT1=9 或 LQT2=16）但静息 QTc <480 毫秒的受试者。 初步结果确定了运动试验、肾上腺素试验和 MST 在家族中的敏感性分别为 60%、95% 和 94%，在阳性对照中为 76%、93% 和 92%，特异性达到 100%每次测试。 这证实了 MST 测试可能对没有明显 QT 延长的长 QT 患者感兴趣。

任务 3：识别与疾病相关的特定基因

目的：鉴定新基因中的罕见变异，这些变异对家系中 VF 的风险有很大贡献。

在南特，有四个大型 IVF 家庭出现了 6 次 SCD（其中 2 次复苏）和 7 次不明原因的晕厥发作。 其中，分别有9、10、11和4名家庭成员在MST和/或其他激发试验后显示QT间期延长，而所有LQTS相关基因均为阴性。 对这一新临床实体的描述最近已被《美国心脏病学会杂志》接受发表17。 家族内遗传距离较远的个体发生 VF/SCD 或 ECG 异常使得谱系对于遗传研究非常有用，因为遗传距离越大，患者共享的变异就越少。 值得注意的是，将对其他亲属进行临床调查（以下系谱上带有问号符号的个体），并可能增加遗传学研究的效力。 J. Barc 和 Nantes 小组之前的工作证明了我们有能力领导此类雄心勃勃的项目，特别是基于家族方法与下一代测序相结合的基因发现。

任务 3.1： 受影响家庭成员的全基因组基因分型和分析 目的：确定受影响成员共有的基因组区域。

将使用 Affymetrix GeneTitan® Multi-Channel 上的 Axiom 全基因组人类精密医学研究阵列 (PMRA) 板对所有受影响的家庭成员进行全基因组基因分型，该仪器可通过我们实验室南特的基因组核心设施获得。 如前所述，受影响的家庭成员共享的基因组区域将通过血统识别（IBD）分析进行评估。 此步骤对于完善致病变异所在的基因组区域至关重要。 根据家族的庞大规模，研究人员可以预期从该分析中会得出一个相对较小的基因组区域。 注意力将集中在可能表明潜在共同基因的家庭之间的潜在共享区域。

任务 3.2： 全基因组测序和分析 目的：识别受影响家庭成员共享的基因组区域中的罕见变异。

在这里，研究人员将对 4 个家系中每个受 CIQTP 综合征影响的 3 个远亲个体进行基因组测序。 基因组测序的优势在于没有捕获和 PCR 步骤，强烈限制了捕获人工制品、未覆盖区域，并提供了在属于非编码区域的基本调控元件内发现突变的可能性。 测序将与国家基因分型中心 (CEA-CNG) 合作进行。 NGS 流程遵循 Broad Institute GATK“最佳实践”broadinstitute.org/gatk/guide/best-practices.php 的建议。 基本上，读取使用 bwa-mem 进行映射，使用 picard 删除重复项，GATK 用于重新对齐和重新校准读取。 这些变体使用 HaplotypeCaller 调用，并使用 GATK 重新校准。 然后使用 Ensembl Variant Effect 预测器对生成的 VCF 进行注释。 从 VCF 文件和每个谱系中，研究人员应优先考虑由 3 个受影响的个体共享并包含在共享基因组区域 (IBD) 中的变体。 从共享变异中，研究人员应关注罕见变异，然后过滤掉一般人群中常见的变异（次要等位基因频率 > 0.1%）。 为此，研究人员将使用公共和内部外显子组/基因组数据库收集总共约 130 000 个外显子组和 20 000 个基因组，例如 gnomAD 联盟、1000Genomes、荷兰基因组和特别来自南特地区的人口统计匹配对照（PREGO 研究-www.vacarme-project.org）。 预计这将导致每个家族的少数“候选”变体/基因的短名单。 SIFT 和 Polyphen2 程序将评估其功能效应的生物信息学预测，以突出其中的假定恶性变异。 研究人员将通过 Sanger 测序验证以这种方式识别的所有变体，并调查它们与各自谱系中其他受影响的家庭成员的共同分离。 我们实验室南特的基因组学和生物信息学核心设施的经验，被公认为法国基因组学 (IBiSA) 和生物信息学 (Institut Français de Bioinformatique) 的国家基础设施，加上我们在 NGS 数据管理方面的经验，将确保这项任务的可行性。 此外，我们小组正在进行一项收集超过 1000 个全基因组（包括心脏病患者和来自普通人群的个体）的大型基因组测序项目。 该项目的经验将加强任务#3 分析的效率和成功的机会。

任务 4：对 CIQTP 患者的诱导多能干细胞衍生心肌细胞进行转录组学和电生理学分析，以确定推定的生物标志物和病理生理机制

研究人员假设 CIQPT 患者产生的诱导多能干细胞衍生心肌细胞 (iPSC-CM) 将使我们能够识别与该疾病相关的整体基因表达变化和电生理学改变。 为此，研究人员的目标是比较任务 3 中描述的 4 个家族成员生成的 iPSC-CM。在每个谱系中，研究人员将选择一名“对照”健康受试者（未出现家族性 QT 延长）和 2 名 CIPQT 患者。

在先前关于 LQT2 的研究的背景下，已经在南特生成并研究了阳性 LQT 对照和阴性健康对照 iPS 细胞系，证明了这项任务的可行性。 这也将提供将 CIPQT 转录组学和电生理学特征与 LTQ2 特征进行比较的机会。 对于每个细胞系，已验证 3 个 iPS 细胞克隆：所有细胞系均具有正常核型并符合当前的多能性标准。 研究人员使用最近描述的一种基于使用小分子对 Wnt/ß-连环蛋白信号进行时间调制的方法，成功地将 iPS 细胞分化为心脏谱系。 初步数据表明，研究人员可以产生高纯度和高效率的心脏分化。 关于来自 LQT2 患者的 iPS 细胞，研究人员表明 hERG A561P 突变导致运输缺陷，导致 IKr 电流降低，从而导致动作电位延长和细胞心律失常（早期后去极化）。

在获得并验证所有 iPS 细胞系后，该项目的第一步将包括鉴定与 CIQTP 相关的心脏基因表达谱。 为此，研究人员将与我们实验室的基因组学核心设施合作，使用从对照细胞和患者来源的 iPS 细胞（第 28 天）分化而来的心肌细胞进行 RNA 序列分析。 研究人员还将在基线条件下和药物诱导的肾上腺素能刺激后，使用自动膜片钳和光学 (CellOptiq®) 技术进行高通量动作电位和离子电流分析。 综合起来，这些分析将为我们提供与人类心肌细胞中 CIQTP 相关的电生理学特征的首次鉴定。 通过这一分析，研究人员将能够将 CIQTP 相关的改变的基因表达程序与缺陷的心脏生理学联系起来。

iPSC 心脏分化方案：细胞将在涂有 Matrigel 的平板上培养并暴露于心源性细胞因子：CHIR 和 IWR-1。 约 10 天后出现跳动菌落。 20 天后，细胞将被解离并重新接种，10 天后用于电生理分析。 最后，在分化28天后，将收集跳动细胞用于RNA seq分析。

全转录组测序 (RNAseq)：在第 28 天从每个 iPS 细胞系的 2 个克隆中收集 3 次分化的 iPSC-CM，并使用 Macherey-Nagel 试剂盒提取 RNA。 然后使用下一代测序（Illumina HiSeq 技术）评估样品中每个 RNA 的存在和数量。 生物信息学分析将由我们实验室的 BIRD 核心设施进行。

通过自动膜片钳记录离子电流：CIQTP 的复极化缺陷可能反映了将使用全细胞膜片钳记录的特定离子电流的功能障碍：钠电流、INa、钙电流、ICa、L 和钾电流、IKs 和 IKr。

动作电位记录：该记录将使用 2 种技术进行。

1. 分离的跳动细胞将使用穿孔膜片钳技术和两性霉素 B 在 37oC 下进行分析。 贴片移液器将充满具有与细胞内液相似的离子组成的溶液。
2. 将在分化 28 天后对心肌细胞进行动作电位光学记录，使用 CellOptiq® 技术（Clyde Biosciences）使用 5 µmol/L di-8-ANEPPS 作为电压敏感染料。 在染料孵育 2 小时和记录期间，细胞将在 37°C、5% CO2 和 20% O2 下孵育。