Продление CIQTP: роль и механизм внезапной сердечной смерти (IQARE-SCD)

Внезапная сердечная смерть (ВСС) является основной причиной смерти в развитых странах. По оценкам, ежегодно во Франции внезапно умирает от 40 000 до 50 000 человек. Большинство этих смертей связано с пожилыми людьми и связано с ишемической болезнью сердца. Тем не менее, по оценкам, от 4000 до 5000 человек в возрасте от 1 до 45 лет внезапно умирают каждый год во Франции. ВСС часто возникает у молодых людей без идентифицируемых аномалий ЭКГ и без структурных дефектов. Как следствие, большинство случаев ВСС у молодых взрослых остаются необъяснимыми и классифицируются в неуловимой группе, известной как идиопатическая фибрилляция желудочков (ЭКО).

Исследователь недавно идентифицировал новую аритмическую сущность (удлинение интервала QT, индуцированное катехоламинами; CIQTP), ответственную за ВСС и характеризующуюся нормальной продолжительностью интервала QT в покое, но значительным удлинением интервала QT во время психического стресс-теста. Целью этого трансляционного проекта является определение распространенности этого нового фенотипа редкого заболевания при необъяснимой ВСС и выявление лежащего в его основе патофизиологического механизма.

Использование психологического стресс-теста может быть распространено на другие наследственные аритмические заболевания, такие как синдром удлиненного интервала QT. Учитывая возможность выявления новых больных родственников, это может привести к значительному снижению риска рецидива внезапной сердечной смерти в семье.

Основной задачей этого проекта является описание клинического значения и патофизиологического механизма этого нового синдрома, приводящего к ВСС.

Основываясь на нашем недавнем описании удлинения интервала QT, вызванного катехоламинами, исследователи предполагают, что:

• Этот синдром частично связан с 60% невыявленного семейного ЭКО после полного семейного скрининга7. Действительно, поскольку исходная ЭКГ нормальна без MST, идентификация таких клинических признаков может быть выполнена с помощью теста на психическую нагрузку у пробанда и родственников, ранее считавшихся незатронутыми наследственной аритмией.
• Психический стресс-тест поможет выявить пограничные случаи других наследственных аритмий, таких как синдром удлиненного интервала QT. Действительно, эта наследственная аритмия характеризуется генетически обусловленным удлинением интервала QT, наблюдаемым на исходной ЭКГ, однако более чем у трети пациентов исходно отмечается лишь незначительное удлинение интервала QT. Следовательно, они требуют использования провокационных тестов (например, тест с физической нагрузкой и адреналиновый тест) для выявления патологического удлинения интервала QT18. Исследователь предполагает, что MST может помочь выявить удлинение интервала QT.
• Основываясь на недавно описанном исследователем аутосомном типе наследования для этого заболевания, исследователи выдвинули гипотезу, что этот синдром относится к менделевским расстройствам. Поэтому исследователи предлагают применить семейный подход для выявления основных генов, связанных с синдромом CIQTP.

Целью этого проекта является описание клинического значения и патофизиологического механизма этого нового синдрома, приводящего к внезапной сердечной смерти. В частности, следователи преследуют следующие цели:

• определить распространенность CIQTP при необъяснимой ВСС и выявить новые большие пораженные семьи
• определить роль психического стресса в удлинении интервала QT
• определить гены, связанные с заболеванием, с помощью секвенирования всего генома и анализа идентичности по происхождению в больших семьях.
• выполнить транскриптомное и электрофизиологическое профилирование индуцированных плюрипотентных кардиомиоцитов, полученных из стволовых клеток (iPSC-CM), у пациентов с CIQTP, чтобы идентифицировать предполагаемые биомаркеры и патофизиологические механизмы.

Основываясь на этом трансляционном подходе, исследователи стремятся описать патофизиологию и клиническое значение CIQTP при внезапной сердечной смерти. Описание этого нового синдрома с использованием инновационного подхода, такого как полногеномное секвенирование и профилирование iPSC-CM, может обеспечить всесторонний и значительный прогресс в области необъяснимой ВСС. Помимо выявления и ухода за вновь заболевшими родственниками, это может помочь определить терапию, основанную на генетике/патофизиологии.

Исследователи уже доказали, что MST является высокоэффективным диагностическим инструментом для выявления этого нового синдрома, и исследователи полагают, что он также может помочь выявить удлинение интервала QT у носителей молчащих мутаций LQTS. Преимущество MST заключается в том, что оно быстрое и простое в применении. Таким образом, может представлять большой интерес выявление семейной сегрегации необъяснимых электрических дефектов сердца, демонстрирующих аутосомно-доминантную передачу. Это может дополнительно уменьшить кажущуюся непроницаемость, встречающуюся в LQTS.

Задачи проекта

Задача 1: определить распространенность CIQTP при необъяснимой ВСС и выявить новые пораженные семьи.

Большинство случаев ВСС в возрасте до 45 лет остаются невыясненными и, вероятно, связаны с наследственной аритмией6. После необъяснимой ВСС в исследование будут включены все последовательные семьи, направленные в Нантскую, Реннскую, Турскую или Брестскую университетские больницы.

Все доступные клинические данные пробанда будут получены от направляющих врачей и родственников. При проведении вскрытия пробанды, чей диагноз будет достижим, будут исключены из исследования.

Семейный скрининг После необъяснимой ВСС в возрасте до 45 лет семейный скрининг будет проводиться среди родственников первой степени родства, а затем в случае положительного результата будет расширен на других родственников. Когда родственники первой степени недоступны для скрининга, он будет проводиться среди более дальних родственников.

Клинический скрининг будет включать обзор прошлой истории болезни, клиническое обследование и исходную ЭКГ. При отсутствии диагноза после этой первой серии обследований, стресс-теста, трансторакальной эхокардиограммы (ТТЭ), пробы с блокаторами натриевых каналов (SCBC) либо аймалином (1 мг/кг), либо флекаинидом (2 мг/кг) и тестом на эпинефрин23, 24 будет выполнено. Психический стресс-тест будет дополнительно выполнен, чтобы выявить удлинение интервала QT с нормальной исходной ЭКГ 25.

Протокол психического стресс-теста (приложение 2) MST будет проводиться следующим образом. Пациенты будут помещены в лежачее положение без объяснения хода теста. ЭКГ будет записываться на исходном уровне и постоянно во время теста. Затем MST будет проводиться резко в соответствии с уровнем образования пациента (арифметика в уме, география или имена персонажей Диснея для детей) с требованием правильных и быстрых ответов. MST будет считаться релевантным при наличии увеличения частоты сердечных сокращений не менее чем на 20 ударов в минуту. В случае отсутствия увеличения частоты сердечных сокращений на 20 ударов в минуту тест будет считаться не интерпретируемым, если не будет выявлено значительное удлинение интервала QTc. MST обычно длится менее 2 минут. Новая ЭКГ будет записана через 30 минут после окончания теста, чтобы попытаться получить кривую ЭКГ с самой низкой частотой сердечных сокращений.

Диагноз

ЭКГ, снятая на исходном уровне, во время стресс-теста и во время фармакологического теста, будет рассмотрена двумя врачами, не имеющими представления о клиническом и генетическом статусе. Все данные будут собраны в основной базе данных.

Критерии диагноза соответствовали рекомендациям последней консенсусной конференции24,26. Исследователи дополнительно рассмотрят дельта QTm> 30 мс во время адреналина или психического стресс-теста и дельта QTc> 30 мс через 3 минуты после стресс-теста как достаточные для диагностики LQTS 27,28.

Минимальный интервал 30 минут между каждым тестом будет соблюдаться, чтобы обеспечить клиренс катехоламинов. Все тесты будут проводиться как минимум через 5 дней после прерывания каждого лечения, которое может помешать тестам.

Это исследование проводится в соответствии с европейскими рекомендациями по клиническим и генетическим исследованиям. Утверждение протокола будет получено от институциональных комитетов по этике. От каждого пациента, давшего согласие на участие в клиническом и генетическом исследовании, будет получено информированное письменное согласие.

Статистический анализ Статистический анализ будет выполняться с помощью программного обеспечения Social Science® (IBM Corp., Армонк, Нью-Йорк). Категориальные переменные будут представлены с их номерами и процентами. Хи-квадрат или точный критерий Фишера (на основе ожидаемой частоты) будут использоваться для сравнения категориальных переменных между группами.

Количественные переменные будут представлены как среднее ± стандартное отклонение или медиана (25-е; 75-е). Анализ непрерывных переменных будет выполняться с использованием t-критерия или критерия Манна-Уитни на основе распределения. Сравнения между семьями будут выполняться с использованием внутрисемейного среднего значения или медианы непрерывной переменной, чтобы ограничить смещение в сторону размера семьи. Двустороннее значение P менее 0,05 будет считаться показателем статистической значимости во всех тестах.

Задача 2: выявить роль психического стресса в удлинении интервала QT.

Для выявления роли психического стресса в удлинении интервала QT исследователи дополнительно набирают группы положительного и отрицательного контроля в университетских больницах Нанта, Ренна, Тура или Бреста.

Это будет заключаться в регистрации последовательных родственников семей, страдающих синдромом удлиненного интервала QT без удлинения интервала QT на исходном уровне. Результат этого теста будет сравниваться с обычным скринингом с использованием теста с физической нагрузкой и теста с адреналином. Таким образом, исследователи стремятся зарегистрировать пациентов, в дальнейшем определяемых как носители основных генетически обусловленных форм синдрома удлиненного интервала QT (LQT1, LQT2 и LQT3, группа положительного контроля).

Исследователи дополнительно зарегистрируют группу отрицательного контроля здоровых пациентов с нормальной исходной ЭКГ, без структурных аномалий сердца и без каких-либо лекарств, которые могли бы повлиять на MST. Эта популяция будет состоять из родственников семей, отрицательных на скрининг необъяснимой ВСС.

Критерии диагностики и протокол испытаний будут идентичны тем, которые определены в задании 1.

Для каждого измерения будут использоваться три последовательных удара, и будет учитываться среднее значение, полученное двумя исследователями. Интервал QT будет измеряться в DII или V5, от начала комплекса QRS до конца зубца Т (определяемого как пересечение касательной зубца Т и изоэлектрической линии). Зубец U будет исключен из измерения интервала QT.

Это исследование проводится в соответствии с европейскими рекомендациями по клиническим и генетическим исследованиям. Утверждение протокола будет получено от институциональных комитетов по этике. От каждого пациента, давшего согласие на участие в клиническом и генетическом исследовании, будет получено информированное письменное согласие.

Статистический анализ будет выполняться с помощью программного обеспечения Social Science® (IBM Corp., Армонк, Нью-Йорк). Сравнения между группами будут проводиться для каждого клинического параметра и параметра ЭКГ на исходном уровне и во время обоих тестов (психический стресс-тест, тест с физической нагрузкой, тест с адреналином). Категориальные переменные будут представлены с их номерами и процентами. Хи-квадрат или точный критерий Фишера (на основе ожидаемой частоты) будут использоваться для сравнения категориальных переменных между группами. Количественные переменные будут представлены как среднее ± стандартное отклонение или медиана (25-е; 75-е). Анализ непрерывных переменных будет выполняться с использованием t-критерия или критерия Манна-Уитни на основе распределения. Двустороннее значение P менее 0,05 будет считаться показателем статистической значимости во всех тестах.

Исследователь уже зарегистрировал в больнице Нант популяцию из 30 здоровых людей из контрольной группы и 25 субъектов с LQTS (LQT1=9 или LQT2=16), но с QTc в покое <480 мс. Первые результаты выявили чувствительность теста с физической нагрузкой, теста с адреналином и MST, соответственно, 60%, 95% и 94% в семьях и 76%, 93% и 92% в положительном контроле, для специфичности 100%, достигнутой для каждое испытание. Это подтверждает, что тест MST может представлять интерес для пациентов с удлиненным интервалом QT при отсутствии явного удлинения интервала QT.

Задача 3: определить конкретные гены, связанные с заболеванием

Цель: Идентифицировать редкие варианты в новых генах, сильно влияющих на риск ФЖ в родословных.

В Нанте были охарактеризованы четыре большие семьи ЭКО с 6 ВСС (из них 2 реанимированы) и 7 необъяснимыми обмороками в молодом возрасте. Среди них, соответственно, 9, 10, 11 и 4 члена семьи демонстрируют удлиненный интервал QT после MST и/или другого провокационного теста, в то время как все гены, связанные с LQTS, были отрицательными. Описание этого нового клинического состояния было недавно принято для публикации в Журнале Американского колледжа кардиологов17. Возникновение аномалий ФЖ / ВСС или ЭКГ у генетически отдаленных людей в семьях делает родословные очень важными для генетических исследований, поскольку чем больше генетическая дистанция, тем меньше вариантов будет у пациентов. Следует отметить, что дополнительные родственники будут подвергнуты клиническому исследованию (лица со знаком вопроса в родословных ниже) и могут повысить эффективность генетического исследования. Предыдущие работы группы J. Barc и Nantes продемонстрировали нашу способность руководить такими амбициозными проектами, особенно в области открытия генов на основе семейного подхода в сочетании с секвенированием нового поколения.

задача 3.1: Полногеномное генотипирование и анализ пораженных членов семьи Цель: определить область генома, общую для пораженных членов.

Полногеномное генотипирование всех затронутых членов семьи будет выполняться с использованием планшета Axiom Genome Human Precision Medicine Research Array (PMRA) на многоканальном инструменте Affymetrix GeneTitan®, доступном в основном геномном центре нашей лаборатории в Нанте. Геномные области, общие для затронутых членов семьи, будут оцениваться с помощью анализа идентичности по происхождению (IBD), как описано ранее. Этот шаг имеет решающее значение для уточнения области генома, в которой находится причинный вариант. Учитывая большой размер семей, исследователи могут ожидать, что в результате этого анализа будет получена относительно небольшая область генома. Внимание будет уделено потенциальному общему региону среди семей, который укажет на потенциальный общий ген.

задача 3.2: Полногеномное секвенирование и анализ Цель: выявить редкие варианты среди геномных областей, общих для пораженных членов семьи.

Здесь исследователи должны провести секвенирование генома у 3 дальних родственников, страдающих синдромом CIQTP, из каждой из 4 родословных. Преимущества секвенирования генома заключаются в отсутствии этапов захвата и ПЦР, что сильно ограничивает артефакты захвата, непокрытые области и дает возможность обнаружить мутацию в существенном регуляторном элементе, принадлежащем некодирующей области. Секвенирование будет проводиться в сотрудничестве с Национальным центром генотипирования (CEA-CNG). Конвейер NGS следует рекомендациям Broad Institute GATK «Best Practices» wideinstitute.org/gatk/guide/best-practices.php. В основном чтения отображаются с помощью bwa-mem, дубликаты удаляются с помощью picard, GATK используется для повторного выравнивания и повторной калибровки чтений. Варианты вызываются с помощью HaplotypeCaller и повторно калибруются с помощью GATK. Сгенерированные VCF затем аннотируются предсказателем Ensembl Variant Effect. В файлах VCF и в каждой родословной исследователи должны определить приоритет вариантов, общих для 3 затронутых лиц и содержащихся в общих геномных областях (IBD). Из общих вариантов исследователи должны сосредоточиться на редких вариантах, а затем отфильтровать варианты, распространенные в общей популяции (частота минорного аллеля >0,1%). Для этого исследователи будут использовать общедоступные и внутренние базы данных экзомов/геномов, собрав в общей сложности около 130 000 экзомов и 20 000 геномов, таких как консорциум gnomAD, 1000Genomes, Геном Нидерландов и контрольные группы с демографическим соответствием, особенно в районе Нанта (исследование PREGO). -www.vacarme-project.org). Ожидается, что это приведет к составлению короткого списка из нескольких вариантов/генов-кандидатов на семейство. Биоинформатический прогноз их функционального эффекта будет оцениваться программами SIFT и Polyphen2, чтобы выделить среди них предполагаемые злокачественные варианты. Исследователи проверят все варианты, идентифицированные таким образом с помощью секвенирования по Сэнгеру, и изучат их совместную сегрегацию с другими затронутыми членами семьи в соответствующих родословных. Опыт основного центра геномики и биоинформатики в Нанте нашей лаборатории, которые признаны французскими национальными инфраструктурами в области геномики (IBiSA) и биоинформатики (Французский институт биоинформатики), в сочетании с нашим опытом в управлении данными NGS обеспечит выполнимость этой задачи. Кроме того, в нашей группе продолжается большой проект по секвенированию генома, в котором собрано более 1000 полных геномов (включая пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями и людей из общей популяции). Опыт этого проекта повысит эффективность анализа задачи № 3 и шансы на успех.

Задача 4: выполнить транскриптомное и электрофизиологическое профилирование индуцированных плюрипотентных кардиомиоцитов, полученных из стволовых клеток, у пациентов с CIQTP для выявления предполагаемых биомаркеров и патофизиологических механизмов.

Исследователи выдвигают гипотезу о том, что индуцированные кардиомиоциты, полученные из плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК-КМ), полученные от пациентов с CIQPT, позволят нам идентифицировать глобальные изменения экспрессии генов и электрофизиологические изменения, связанные с заболеванием. Для этого исследователи стремятся сравнить иПСК-КМ, полученные от членов 4 семей, описанных в задаче 3. В каждой родословной исследователи выберут одного «контрольного» здорового субъекта (без семейного удлинения интервала QT) и 2 пациентов с CIPQT.

Положительный контроль LQT и отрицательные здоровые контрольные линии iPS-клеток уже были созданы и изучены в Нанте в контексте предыдущего исследования LQT2, демонстрирующего выполнимость этой задачи. Это также даст возможность сравнить транскриптомную и электрофизиологическую сигнатуру CIPQT с сигнатурами LTQ2. Для каждой линии валидировано 3 клона иПС-клеток: все линии имеют нормальный кариотип и соответствуют современным стандартам плюрипотентности. Исследователи успешно дифференцировали iPS клетки в сердечную линию, используя недавно описанный метод, основанный на временной модуляции передачи сигналов Wnt/β-catenin с использованием малых молекул. Предварительные данные свидетельствуют о том, что исследователи могут добиться высокой чистоты и эффективности дифференцировки сердца. Что касается iPS-клеток от пациента с LQT2, исследователи показали, что мутация hERG A561P приводит к дефекту переноса, который приводит к снижению тока IKr и, следовательно, к пролонгации потенциала действия и клеточным аритмиям (ранним постдеполяризациям).

После получения и проверки всех линий iPS-клеток первый шаг проекта будет состоять в идентификации профиля экспрессии кардиального гена, связанного с CIQTP. Для этого исследователи будут использовать кардиомиоциты, дифференцированные из контрольных и полученных от пациентов иПС-клеток (день 28), для проведения анализа секвенирования РНК в сотрудничестве с основным центром Genomics нашей лаборатории. Исследователи также проведут высокопроизводительные анализы потенциала действия и ионного тока с использованием автоматизированных методов зажима патчей и оптических методов (CellOptiq®) в исходных условиях и после медикаментозной адренергической стимуляции. В совокупности эти анализы дадут нам первую идентификацию электрофизиологического профиля, связанного с CIQTP в кардиомиоцитах человека. С помощью этого анализа исследователи смогут связать программу измененной экспрессии генов, связанную с CIQTP, с дефектами сердечной физиологии.

Протоколы сердечной дифференцировки иПСК: клетки будут культивироваться на планшете, покрытом матригелем, и подвергаться воздействию кардиогенных цитокинов: CHIR и IWR-1. Бьющиеся колонии появляются примерно через 10 дней. Через 20 дней клетки будут диссоциированы и повторно засеяны для электрофизиологического анализа через 10 дней. Наконец, после 28 дней дифференцировки бьющиеся клетки будут собраны для анализа секвенирования РНК.

Полное секвенирование транскриптома (RNAseq): отбирают иПСК-КМ на 28-й день 3 дифференцировки из 2 клонов каждой линии иПС-клеток и экстрагируют РНК с использованием набора Macherey-Nagel. Присутствие и количество каждой РНК в образцах затем оценивают с помощью секвенирования нового поколения (технология Illumina HiSeq). Биоинформатический анализ будет выполняться основным подразделением BIRD нашей лаборатории.

Запись ионного тока с помощью автоматического патч-клампа: дефекты реполяризации CIQTP, вероятно, отражают дисфункцию специфических ионных токов, которые будут зарегистрированы с помощью патч-клэмпа всей клетки: натриевый ток, INa, кальциевый ток, ICa, L и калиевый ток, IKs и IKr.

Запись потенциала действия: эта запись будет выполняться с использованием 2 методов.

1. Изолированные бьющиеся клетки будут проанализированы с использованием техники перфорированного патч-клэмпа с амфотерицином В при 37oC. Патч-пипетки будут заполнены раствором, который имеет ионный состав, аналогичный внутриклеточной жидкости.
2. Оптические записи потенциала действия будут выполняться на кардиомиоцитах после 28 дней дифференцировки с 5 мкмоль/л ди-8-ANEPPS в качестве чувствительного к напряжению красителя с использованием технологии CellOptiq® (Clyde Biosciences). Клетки будут инкубировать при 37 ° C, 5% CO2 и 20% O2 в течение 2 часов инкубации красителя и во время записи.