Prolongation du CIQTP : rôle et mécanisme dans la mort subite cardiaque (IQARE-SCD)

La mort cardiaque subite (SCD) est une cause majeure de décès dans les pays développés. On estime que 40 000 à 50 000 personnes meurent subitement chaque année en France. La plupart de ces décès concernent des personnes âgées et sont liés à une maladie coronarienne. Or, on estime que 4 000 à 5 000 personnes âgées de 1 à 45 ans meurent subitement chaque année en France. La SCD survient souvent chez les jeunes victimes sans anomalies ECG identifiables et sans défauts structurels. En conséquence, la plupart des événements de SCD chez le jeune adulte restent inexpliqués et sont classés dans un groupe insaisissable connu sous le nom de fibrillation ventriculaire idiopathique (FIV).

L'investigateur a récemment identifié une nouvelle entité arythmique (allongement de l'intervalle QT induit par les catécholamines ; CIQTP) responsable de la SCD et caractérisée par une durée normale de l'intervalle QT au repos mais un allongement majeur de l'intervalle QT lors d'un test de stress mental. L'objectif de ce projet translationnel est de déterminer la prévalence de ce nouveau phénotype de maladie rare dans la SCD inexpliquée et d'identifier son mécanisme physiopathologique sous-jacent.

L'utilisation du test de stress mental pourrait être étendue à d'autres maladies arythmiques héréditaires telles que le syndrome du QT long. Compte tenu du potentiel d'identification de nouveaux parents touchés, cela peut conduire à une réduction significative du risque de récidive de mort cardiaque subite dans une famille.

L'enjeu principal de ce projet est de décrire l'implication clinique et le mécanisme physiopathologique de ce nouveau syndrome conduisant à la SCD.

Sur la base de notre récente description de cet allongement de l'intervalle QT induit par la cathécholamine, les chercheurs émettent l'hypothèse que :

• Ce syndrome est en partie impliqué dans les 60 % de FIV familiales non diagnostiquées après dépistage familial complet7. En effet, comme l'ECG de base est normal sans MST, l'identification de ces caractéristiques cliniques peut être réalisée par un test de stress mental chez le proposant et les proches précédemment considérés comme non affectés par une maladie arythmique héréditaire.
• Le test de stress mental aidera à identifier les cas limites d'autres arythmies héréditaires telles que le syndrome du QT long. En effet, cette arythmie héréditaire se caractérise par un allongement génétique de l'intervalle QT observé sur l'ECG initial, cependant plus d'un tiers des patients ne présentent qu'un léger allongement QT à l'inclusion. Par conséquent, ils nécessitent l'utilisation de tests de provocation (par ex. test d'effort et test d'adrénaline) pour démasquer l'allongement pathologique de l'intervalle QT18. L'investigateur émet l'hypothèse que le MST peut aider à démasquer cet allongement de l'intervalle QT.
• Sur la base du mode de transmission autosomique décrit récemment pour cette maladie, les chercheurs émettent l'hypothèse que ce syndrome appartient aux troubles mendéliens. Par conséquent, les chercheurs proposent d'appliquer une approche basée sur la famille pour identifier les principaux gènes associés au syndrome CIQTP.

L'objectif de ce projet est de décrire l'implication clinique et le mécanisme physiopathologique de ce nouveau syndrome conduisant à la mort cardiaque subite. Plus précisément, les enquêteurs visent à :

• déterminer la prévalence du CIQTP dans la SCD inexpliquée et identifier de nouvelles familles nombreuses atteintes
• identifier le rôle du stress mental dans l'allongement de l'intervalle QT
• identifier les gènes associés à la maladie en combinant le séquençage du génome entier et l'analyse de l'identité par descendance dans les familles nombreuses
• effectuer un profilage transcriptomique et électrophysiologique des cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSC-CM) de patients CIQTP afin d'identifier des biomarqueurs putatifs et des mécanismes physiopathologiques.

Sur la base de cette approche translationnelle, les chercheurs visent à décrire la physiopathologie et l'implication clinique du CIQTP dans la mort cardiaque subite. La description de ce nouveau syndrome à l'aide d'approches innovantes telles que le séquençage du génome entier et le profilage iPSC-CM peut fournir un progrès complet et majeur dans le domaine de la SCD inexpliquée. Au-delà de l'identification et de la prise en charge des parents nouvellement touchés, cela peut aider à définir une thérapie basée sur la génétique/pathophysiologie.

Les chercheurs ont déjà prouvé que le MST est un outil de diagnostic très efficace pour détecter ce nouveau syndrome, et les chercheurs pensent qu'il peut également aider à démasquer l'allongement de l'intervalle QT chez les porteurs silencieux de la mutation LQTS. MST a l'avantage d'être simple et rapide à appliquer. Il pourrait donc être d'un grand intérêt de mettre en évidence la ségrégation familiale des malformations électriques cardiaques inexpliquées à transmission autosomique dominante. Cela pourrait en outre diminuer la non-pénétrance apparente rencontrée dans le LQTS.

Tâches du projet

Tâche 1 : déterminer la prévalence du CIQTP dans les cas de drépanocytose inexpliquée et identifier de nouvelles familles touchées

La plupart des cas de SCD avant l'âge de 45 ans restent inexpliqués et sont probablement dus à une arythmie héréditaire6. Après une DSC inexpliquée, toutes les familles consécutives adressées aux CHU de Nantes, Rennes, Tours ou Brest seront incluses dans l'étude.

Toutes les données cliniques probantes disponibles seront recueillies auprès des médecins référents et des proches. Lorsque l'autopsie est réalisée, les proposants dont le diagnostic sera réalisable seront exclus de l'étude.

Dépistage familial Après une MSC inexpliquée avant l'âge de 45 ans, un dépistage familial sera réalisé chez les parents au premier degré puis étendu aux autres parents s'il est positif. Lorsque les parents au premier degré ne sont pas disponibles pour le dépistage, celui-ci sera effectué chez des parents plus éloignés.

Le dépistage clinique comprendra un examen des antécédents médicaux, un examen clinique et un ECG de base. En l'absence de diagnostic après cette première série d'examens, épreuve d'effort, échocardiographie transthoracique (TTE), challenge inhibiteur des canaux sodiques (SCBC) soit avec de l'ajmaline (1 mg/kg) soit de la flécaïnide (2 mg/kg) et un test d'épinéphrine23, 24 seront exécutés. Un test de stress mental sera également effectué pour démasquer l'allongement de l'intervalle QT avec un ECG de base normal 25.

Protocole du test d'effort mental (annexe 2) Le MST sera effectué comme suit. Les patients seront placés en décubitus dorsal sans explication sur le déroulement du test. L'ECG sera enregistré au départ et en permanence pendant le test. Le MST sera alors réalisé brutalement selon le niveau d'éducation du patient (calcul mental, géographie ou noms de personnages Disney pour les enfants) avec une exigence de réponses correctes et rapides. Le MST sera considéré comme pertinent en présence d'une augmentation d'au moins 20 battements par minute de la fréquence cardiaque. En cas d'absence d'augmentation de 20 battements par minute de la fréquence cardiaque, le test sera considéré comme non interprétable sauf si un allongement significatif du QTc est identifié. Le MST dure généralement moins de 2 minutes. Un nouvel ECG sera enregistré 30 minutes après la fin du test pour tenter d'obtenir un tracé ECG avec la fréquence cardiaque la plus basse.

Diagnostic

L'ECG effectué au départ, pendant le test d'effort et pendant le test pharmacologique sera revu par deux médecins aveugles au statut clinique et génétique. Toutes les données seront collectées dans une base de données centrale.

Les critères de diagnostic ont adhéré aux lignes directrices de la dernière conférence de consensus24,26. Les enquêteurs considéreront en outre un delta QTm> 30 ms pendant l'épinéphrine ou le test de stress mental et un delta QTc> 30 ms à 3 min après le test de stress, comme suffisant pour le diagnostic de LQTS 27,28.

Un intervalle minimum de 30 minutes entre chaque test sera observé pour permettre la clairance des catécholamines. Tous les tests seront effectués au moins 5 jours après l'interruption de chaque traitement qui pourrait interférer avec les tests.

Cette étude est menée selon les directives européennes pour la recherche clinique et génétique. L'approbation du protocole sera obtenue auprès des comités d'éthique institutionnels. Un consentement écrit éclairé sera obtenu de chaque patient ayant accepté de participer à l'étude clinique et génétique.

Analyse statistique Les analyses statistiques seront effectuées avec le logiciel Social Science® (IBM Corp., Armonk, New York). Les variables catégorielles seront présentées avec leurs nombres et pourcentages. Le test exact du chi carré ou de Fisher (basé sur la fréquence attendue) sera utilisé pour comparer les variables catégorielles entre les groupes.

Les variables quantitatives seront présentées sous forme de moyenne ± écart type ou médiane (25e ; 75e). L'analyse des variables continues sera effectuée à l'aide d'un test t ou d'un test de Mann Whitney basé sur la distribution. Les comparaisons entre les familles seront effectuées en utilisant la valeur moyenne intra-familiale ou la médiane de la variable continue afin de limiter le biais vers la taille de la famille. Une valeur P bilatérale inférieure à 0,05 sera considérée comme indiquant une signification statistique dans tous les tests.

Tâche 2 : identifier le rôle du stress mental dans l'allongement de l'intervalle QT

Pour identifier le rôle du stress mental dans l'allongement de l'intervalle QT, les chercheurs recruteront en outre des groupes témoins positifs et négatifs dans les CHU de Nantes, Rennes, Tours ou Brest.

Cela consistera à recruter des parents consécutifs de familles touchées par le syndrome du QT long sans allongement du QT au départ. Le résultat de ce test sera comparé à un dépistage conventionnel utilisant un test d'effort et un test d'épinéphrine. Ainsi, les chercheurs visent à recruter des patients définis plus précisément comme porteurs des principales formes génétiques du syndrome du QT long (LQT1, LQT2 et LQT3, groupe témoin positif).

Les enquêteurs recruteront en outre un groupe témoin négatif de patients en bonne santé avec un ECG de base normal, sans anomalies structurelles cardiaques et sans aucun médicament susceptible d'interférer avec le MST. Cette population sera constituée des proches des familles négatives au dépistage inexpliqué de la SCD.

Les critères de diagnostic et le protocole de test seront identiques à ceux définis dans la tâche 1.

Trois battements consécutifs seront utilisés pour chaque mesure et la valeur moyenne obtenue par les deux investigateurs sera prise en compte. L'intervalle QT sera mesuré en DII ou V5, du début du complexe QRS à la fin de l'onde T (définie comme l'intersection de la tangente de l'onde T et de la ligne isoélectrique). L'onde U sera exclue de la mesure de l'intervalle QT.

Cette étude est menée selon les directives européennes pour la recherche clinique et génétique. L'approbation du protocole sera obtenue auprès des comités d'éthique institutionnels. Un consentement écrit éclairé sera obtenu de chaque patient qui a accepté de participer à l'étude clinique et génétique.

Les analyses statistiques seront effectuées avec le logiciel Social Science® (IBM Corp., Armonk, New York). Des comparaisons entre les groupes seront effectuées pour chaque paramètre clinique et ECG au départ et pendant les deux tests (test de stress mental, test d'effort, test d'épinéphrine). Les variables catégorielles seront présentées avec leurs nombres et pourcentages. Le test exact du chi carré ou de Fisher (basé sur la fréquence attendue) sera utilisé pour comparer les variables catégorielles entre les groupes. Les variables quantitatives seront présentées sous forme de moyenne ± écart type ou médiane (25e ; 75e). L'analyse des variables continues sera effectuée à l'aide d'un test t ou d'un test de Mann Whitney basé sur la distribution. Une valeur P bilatérale inférieure à 0,05 sera considérée comme indiquant une signification statistique dans tous les tests.

L'investigateur a déjà recruté à l'hôpital de Nantes une population de 30 témoins sains et 25 sujets atteints de LQTS (LQT1=9 ou LQT2=16) mais avec un QTc au repos<480 ms. Les premiers résultats ont identifié une sensibilité du test d'effort, du test d'épinéphrine et du MST respectivement de 60%, 95% et 94% au sein des familles, et de 76%, 93% et 92% au sein des contrôles positifs, pour une spécificité de 100% atteinte pour chaque essai. Cela confirme que le test MST peut être intéressant chez les patients à QT long sans allongement net de QT.

Tâche 3 : identifier les gènes spécifiques associés à la maladie

Objectif : Identifier des variants rares dans de nouveaux gènes contribuant fortement au risque de FV au sein des pedigrees.

Quatre familles nombreuses de FIV présentant 6 épisodes de SCD (dont 2 réanimés) et 7 épisodes de syncope inexpliquée survenant à un jeune âge ont été caractérisées à Nantes. Parmi eux, respectivement 9, 10, 11 et 4 membres de la famille présentent un intervalle QT prolongé après MST et/ou un autre test de provocation alors que tous les gènes associés au LQTS étaient négatifs. La description de cette nouvelle entité clinique a été récemment acceptée pour publication dans le Journal of the American College of Cardiology17. L'apparition d'anomalies VF/SCD ou ECG chez des individus génétiquement éloignés au sein des familles rend les pedigrees très puissants pour les études génétiques, car plus la distance génétique est grande, moins les patients partageront de variantes. Il convient de noter que des parents supplémentaires feront l'objet d'une enquête clinique (individu avec des symboles de point d'interrogation sur les pedigrees ci-dessous) et peuvent augmenter la puissance de l'étude génétique. Les travaux antérieurs de J. Barc et du groupe nantais ont démontré notre capacité à mener des projets aussi ambitieux et plus particulièrement sur la découverte de gènes basée sur une approche familiale couplée au séquençage de nouvelle génération.

tâche3.1 : Génotypage du génome entier et analyse des membres de la famille touchés Objectif : Identifier une région génomique partagée par les membres touchés.

Le génotypage à l'échelle du génome de tous les membres de la famille touchés sera effectué à l'aide de la plaque Axiom Genome-Wide Human Precision Medicine Research Array (PMRA) sur Affymetrix GeneTitan® Multi-Channel, instrument disponible via la plateforme génomique de Nantes de notre laboratoire. Les régions génomiques partagées par les membres de la famille touchés seront évaluées par l'analyse IBD (Identity By Descent) comme décrit précédemment. Cette étape est cruciale pour affiner la région du génome où se situe le variant causal. Selon la grande taille des familles, les chercheurs peuvent s'attendre à ce qu'une région génomique relativement petite ressorte de cette analyse. L'attention sera consacrée à la région partagée potentielle entre les familles qui indiquerait un gène commun potentiel.

tâche3.2 : Séquençage et analyse du génome entier Objectif : identifier les variants rares parmi les régions génomiques partagées par les membres de la famille touchés.

Ici, les enquêteurs effectueront le séquençage du génome chez 3 individus éloignés atteints du syndrome CIQTP de chacun des 4 pedigrees. Les avantages du séquençage du génome résident dans l'absence d'étapes de capture et de PCR, limitant fortement les artefacts de capture, les régions non couvertes et offrant la possibilité de découvrir une mutation au sein d'un élément régulateur essentiel appartenant à la région non codante. Le séquençage sera réalisé en collaboration avec le Centre National de Génotypage (CEA-CNG). Le pipeline NGS suit les recommandations du Broad Institute GATK "Best Practices" broadinstitute.org/gatk/guide/best-practices.php. Fondamentalement, les lectures sont mappées à l'aide de bwa-mem, les doublons sont supprimés à l'aide de picard, GATK est utilisé pour réaligner et recalibrer les lectures. Les variantes sont appelées avec HaplotypeCaller et sont recalibrées avec GATK. Les VCF générés sont ensuite annotés avec le prédicteur Ensembl Variant Effect. A partir des fichiers VCF et au sein de chaque pedigree, les investigateurs prioriseront les variants partagés par les 3 individus concernés et contenus dans les régions génomiques partagées (IBD). À partir des variantes partagées, les enquêteurs doivent se concentrer sur les variantes rares, puis filtrer les variantes courantes dans la population générale (fréquence des allèles mineurs > 0,1 %). Pour cela, les chercheurs utiliseront des bases de données publiques et internes sur les exomes / génomes rassemblant au total environ 130 000 exomes et 20 000 génomes tels que le consortium gnomAD, 1000Genomes, le génome des Pays-Bas et des contrôles appariés démographiques spécifiquement de la région de Nantes (étude PREGO -www.vacarme-project.org). Cela devrait aboutir à une liste restreinte de quelques variantes/gènes "candidats" par famille. Une prédiction bioinformatique de leur effet fonctionnel sera évaluée par les programmes SIFT et Polyphen2 pour mettre en évidence des variants malins putatifs parmi ceux-ci. Les enquêteurs valideront toutes les variantes identifiées de cette manière par le séquençage Sanger et enquêteront sur leur co-ségrégation avec d'autres membres de la famille concernés dans les pedigrees respectifs. L'expérience de la plate-forme de génomique et de bioinformatique de Nantes de notre laboratoire, qui sont reconnues comme infrastructures nationales françaises en génomique (IBiSA) et en bioinformatique (Institut Français de Bioinformatique) couplée à notre expérience dans la gestion des données NGS assurera la faisabilité de cette tâche. De plus, un grand projet de séquençage du génome rassemblant plus de 1000 génomes entiers (y compris des patients cardiaques et des individus de la population générale) est en cours dans notre groupe. L'expérience de ce projet renforcera l'efficacité de l'analyse de la tâche 3 et les chances de succès.

Tâche 4 : effectuer un profilage transcriptomique et électrophysiologique de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites de patients CIQTP afin d'identifier des biomarqueurs putatifs et des mécanismes physiopathologiques

Les chercheurs font l'hypothèse que les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSC-CM) générés à partir de patients CIQPT nous permettront d'identifier les changements globaux d'expression génique et les altérations électrophysiologiques associées à la maladie. Pour cela, les investigateurs visent à comparer les CSPi-CM générés à partir des membres des 4 familles décrites dans la tâche 3. Au sein de chaque pedigree, les investigateurs sélectionneront un sujet sain "contrôle" (ne présentant pas l'allongement QT familial), et 2 patients CIPQT.

Des lignées cellulaires iPS contrôle positif LQT et contrôle sain négatif ont déjà été générées et étudiées à Nantes dans le cadre d'une précédente étude sur LQT2 démontrant la faisabilité de cette tâche. Cela offrira également l'opportunité de comparer la signature transcriptomique et électrophysiologique du CIPQT à celle du LTQ2. Pour chaque lignée, 3 clones de cellules iPS ont été validés : toutes les lignées ont un caryotype normal et répondent aux normes en vigueur de pluripotence. Les chercheurs ont réussi à différencier les cellules iPS dans la lignée cardiaque, en utilisant une méthode récemment décrite basée sur la modulation temporelle de la signalisation Wnt/ß-caténine à l'aide de petites molécules. Les données préliminaires suggèrent que les chercheurs peuvent générer une pureté et une efficacité élevées de la différenciation cardiaque. En ce qui concerne les cellules iPS du patient LQT2, les chercheurs ont montré que la mutation hERG A561P entraîne un défaut de trafic qui entraîne une réduction du courant IKr, et par conséquent une prolongation du potentiel d'action et des arythmies cellulaires (après dépolarisations précoces).

Après obtention et validation de toutes les lignées cellulaires iPS, la première étape du projet consistera en l'identification du profil d'expression des gènes cardiaques associés au CIQTP. Pour cela, les chercheurs utiliseront des cardiomyocytes différenciés de cellules iPS témoins et dérivées de patients (jour 28) pour effectuer des analyses de séquençage d'ARN, en collaboration avec la plateforme de génomique de notre laboratoire. Les chercheurs effectueront également des analyses de potentiel d'action et de courant ionique à haut débit à l'aide de techniques automatisées de patch-clamp et de techniques optiques (CellOptiq®) dans des conditions de base et après une stimulation adrénergique induite par des médicaments. Toutes combinées, ces analyses nous fourniront la première identification du profil électrophysiologique associé au CIQTP dans les cardiomyocytes humains. Grâce à cette analyse, les chercheurs seront en mesure de lier le programme d'expression génique altérée associé au CIQTP à une physiologie cardiaque défectueuse.

Protocoles de différenciation cardiaque iPSC : les cellules seront cultivées sur une plaque revêtue de Matrigel et exposées à des cytokines cardiogéniques : CHIR et IWR-1. Les colonies battantes apparaissent après environ 10 jours. Après 20 jours, les cellules seront dissociées et réensemencées pour des analyses électrophysiologiques, 10 jours plus tard. Enfin, après 28 jours de différenciation, les cellules battantes seront collectées pour l'analyse de l'ARN seq.

Séquençage du transcriptome entier (RNAseq) : battre les iPSC-CM à 28 jours de 3 différenciations à partir de 2 clones de chaque lignée cellulaire iPS seront collectés et l'ARN sera extrait à l'aide du kit Macherey-Nagel. La présence et la quantité de chaque ARN des échantillons seront ensuite évaluées à l'aide d'un séquençage de nouvelle génération (technologie Illumina HiSeq). L'analyse bioinformatique sera effectuée par la plateforme BIRD de notre laboratoire.

Enregistrements de courant ionique par patch-clamp automatisé : les défauts de repolarisation du CIQTP reflètent probablement un dysfonctionnement de courants ioniques spécifiques qui seront enregistrés à l'aide d'un patch-clamp de cellules entières : courant de sodium, INa, courant de calcium, ICa,L et courants de potassium, IKs et IKr.

Enregistrement du potentiel d'action : Cet enregistrement sera réalisé en utilisant 2 techniques.

1. Les cellules battantes isolées seront analysées en utilisant la technique du patch-clamp perforé avec de l'amphotéricine B à 37oC. Les pipettes patch seront remplies d'une solution qui a une composition ionique similaire au liquide intracellulaire.
2. Des enregistrements optiques de potentiel d'action seront effectués sur des cardiomyocytes après 28 jours de différenciation, avec 5 µmol/L de di-8-ANEPPS comme colorant sensible au voltage en utilisant la technologie CellOptiq® (Clyde Biosciences). Les cellules seront incubées à 37 °C, 5 % de CO2 et 20 % d'O2 pendant les 2 h d'incubation du colorant et pendant l'enregistrement.