Prolongamento do CIQTP: Papel e Mecanismo na Morte Cardíaca Súbita (IQARE-SCD)

A morte súbita cardíaca (MSC) é uma das principais causas de morte nos países desenvolvidos. Estima-se que 40.000 a 50.000 pessoas morram repentinamente a cada ano na França. A maioria dessas mortes envolve idosos e está relacionada à doença arterial coronariana. No entanto, cerca de 4.000 a 5.000 indivíduos entre 1 e 45 anos de idade morrem repentinamente a cada ano na França. A MSC geralmente ocorre em vítimas jovens sem anormalidades identificáveis ​​no ECG e sem defeitos estruturais. Em consequência, a maioria dos eventos de MSC no adulto jovem permanece inexplicável e é classificada em um grupo elusivo conhecido como fibrilação ventricular idiopática (FIV).

O investigador identificou recentemente uma nova entidade arrítmica (prolongamento do QT induzido por catecolaminas; CIQTP) responsável pela SCD e caracterizada pela duração normal do QT em repouso, mas maior prolongamento do QT durante o teste de estresse mental. O objetivo deste projeto translacional é determinar a prevalência deste novo fenótipo de doença rara em SCD inexplicável e identificar seu mecanismo fisiopatológico subjacente.

O uso do teste de estresse mental pode ser estendido a outras doenças arrítmicas hereditárias, como a síndrome do QT longo. Dado o potencial de identificação de novos parentes afetados, pode levar a uma redução significativa do risco de recorrência de morte súbita cardíaca em uma família.

A principal questão deste projeto é descrever a implicação clínica e o mecanismo fisiopatológico desta nova síndrome que leva à MSC.

Com base em nossa descrição recente desse prolongamento do intervalo QT induzido por catecolaminas, os investigadores levantam a hipótese de que:

• Essa síndrome está parcialmente envolvida em 60% das FIV familiares não diagnosticadas após triagem familiar completa7. De fato, como o ECG basal é normal sem MST, a identificação de tais características clínicas pode ser realizada por teste de estresse mental em probandos e parentes anteriormente considerados não afetados por doença arrítmica hereditária.
• O teste de estresse mental ajudará a identificar casos limítrofes de outras arritmias hereditárias, como a síndrome do QT longo. De fato, essa arritmia hereditária é caracterizada por um prolongamento de base genética do intervalo QT observado no ECG basal, porém mais de um terço dos pacientes apresenta apenas um ligeiro prolongamento QT basal. Consequentemente, requerem o uso de testes de provocação (p. teste ergométrico e teste de adrenalina) para desmascarar prolongamento patológico do intervalo QT18. O investigador levanta a hipótese de que o MST pode ajudar a desmascarar esse prolongamento do intervalo QT.
• Com base no modo de herança autossômica recentemente descrito para esta doença, o investigador levanta a hipótese de que esta síndrome pertence aos distúrbios mendelianos. Portanto, os pesquisadores propõem aplicar uma abordagem familiar para identificar os principais genes associados à síndrome CIQTP.

O escopo deste projeto é descrever a implicação clínica e o mecanismo fisiopatológico desta nova síndrome que leva à morte súbita cardíaca. Mais especificamente, os investigadores visam:

• determinar a prevalência de CIQTP em SCD inexplicável e identificar novas grandes famílias afetadas
• identificar o papel do estresse mental no prolongamento do intervalo QT
• identificar genes associados à doença combinando sequenciamento do genoma completo e análise de identidade por descendência em famílias numerosas
• realizar perfis transcriptômicos e eletrofisiológicos de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC-CM) de pacientes CIQTP para identificar biomarcadores putativos e mecanismos fisiopatológicos.

Com base nessa abordagem translacional, os pesquisadores pretendem descrever a fisiopatologia e a implicação clínica do CIQTP na morte súbita cardíaca. A descrição desta nova síndrome usando uma abordagem inovadora, como o sequenciamento completo do genoma e o perfil iPSC-CM, pode fornecer um progresso abrangente e importante no campo da SCD inexplicável. Além da identificação e cuidado de parentes recém-acometidos, pode auxiliar na definição de uma terapia baseada na genética/fisiopatologia.

Os investigadores já provaram que o MST é uma ferramenta de diagnóstico altamente eficiente para detectar esta nova síndrome, e os investigadores acreditam que também pode ajudar a desmascarar o prolongamento do intervalo QT em portadores silenciosos da mutação LQTS. O MST tem a vantagem de ser rápido e simples de aplicar. Portanto, pode ser de grande interesse descobrir a segregação familiar para defeitos elétricos cardíacos inexplicados que mostram transmissão autossômica dominante. Além disso, poderia diminuir a aparente não penetrância encontrada na LQTS.

Tarefas do projeto

Tarefa 1: determinar a prevalência de CIQTP em SCD inexplicável e identificar novas famílias afetadas

A maioria dos casos de MSC antes dos 45 anos de idade permanece inexplicável e provavelmente decorre de doença arrítmica hereditária6. Após MSC inexplicável, todas as famílias consecutivas encaminhadas para os Hospitais Universitários de Nantes, Rennes, Tours ou Brest serão incluídas no estudo.

Todos os dados do probando clínico disponíveis serão coletados dos médicos e parentes que o encaminharam. Quando a autópsia for realizada, os probandos cujo diagnóstico será alcançável serão excluídos do estudo.

Triagem familiar Após DF inexplicada antes dos 45 anos, a triagem familiar será realizada em parentes de primeiro grau e, em seguida, estendida a outros parentes se for positiva. Quando parentes de primeiro grau não estiverem disponíveis para triagem, ela será realizada em parentes mais distantes.

A triagem clínica incluirá uma revisão do histórico médico anterior, exame clínico e ECG inicial. Na ausência de diagnóstico após este primeiro conjunto de exames, teste de estresse, ecocardiograma transtorácico (ETT), desafio com bloqueador de canal de sódio (SCBC) seja com ajmalina (1 mg/kg) ou flecainida (2 mg/kg) e um teste de epinefrina23, 24 será realizado. O teste de estresse mental será realizado adicionalmente para desmascarar o prolongamento do intervalo QT com ECG basal normal 25.

O protocolo de teste de estresse mental (apêndice 2) MST será realizado da seguinte forma. Os pacientes serão colocados em decúbito dorsal sem nenhuma explicação sobre o andamento do teste. O ECG será registrado na linha de base e permanentemente durante o teste. O MST será então realizado abruptamente de acordo com o nível de escolaridade do paciente (aritmética mental, geografia ou nomes de personagens da Disney para crianças) com a exigência de respostas corretas e rápidas. O MST será considerado relevante na presença de um aumento de pelo menos 20 batimentos por minuto na frequência cardíaca. Na ausência de aumento de 20 batimentos por minuto na frequência cardíaca, o teste será considerado não interpretável, a menos que seja identificado um prolongamento significativo do intervalo QTc. MST geralmente dura menos de 2 minutos. Um novo ECG será registrado 30 minutos após o término do teste na tentativa de obter um traçado de ECG com a menor frequência cardíaca.

Diagnóstico

O ECG realizado no início do estudo, durante o teste de esforço e durante o teste farmacológico será revisado por dois médicos cegos para o estado clínico e genético. Todos os dados serão coletados em um banco de dados central.

Os critérios diagnósticos seguiram as diretrizes da última conferência de consenso24,26. Os investigadores considerarão adicionalmente um delta QTm > 30 ms durante a epinefrina ou o teste de estresse mental e um delta QTc > 30 ms 3 min após o teste de estresse, como suficientes para o diagnóstico de SQTL 27,28.

Será observado um intervalo mínimo de 30 minutos entre cada teste para permitir a depuração das catecolaminas. Todos os testes serão realizados pelo menos 5 dias após a interrupção de cada tratamento que possa interferir nos testes.

Este estudo é conduzido de acordo com as diretrizes europeias para pesquisa clínica e genética. A aprovação do protocolo será obtida em comitês de ética institucionais. O consentimento informado por escrito será obtido de cada paciente que concordou em participar do estudo clínico e genético.

Análise estatística As análises estatísticas serão realizadas com o software Social Science® (IBM Corp., Armonk, Nova York). As variáveis ​​categóricas serão apresentadas com seus números e porcentagens. O teste do qui-quadrado ou exato de Fisher (baseado na frequência esperada) será usado para comparar as variáveis ​​categóricas entre os grupos.

As variáveis ​​quantitativas serão apresentadas como média ± desvio padrão ou mediana (25º; 75º). A análise das variáveis ​​contínuas será realizada por meio do teste t ou teste de Mann Whitney baseado na distribuição. As comparações entre as famílias serão realizadas usando o valor médio intrafamiliar ou mediana da variável contínua, a fim de limitar o viés para o tamanho da família. Um valor P bilateral inferior a 0,05 será considerado para indicar significância estatística em todos os testes.

Tarefa 2: identificar o papel do estresse mental no prolongamento do intervalo QT

Para identificar o papel do estresse mental no prolongamento do intervalo QT, os investigadores também inscreverão grupos de controle positivo e negativo nos Hospitais Universitários de Nantes, Rennes, Tours ou Brest.

Isso consistirá na inscrição de parentes consecutivos de famílias afetadas pela síndrome do QT longo sem prolongamento do intervalo QT no início do estudo. O resultado deste teste será comparado à triagem convencional por meio de teste ergométrico e teste de epinefrina. Assim, os investigadores pretendem inscrever pacientes definidos como portadores das principais formas de base genética da síndrome do QT longo (LQT1, LQT2 e LQT3, grupo de controle positivo).

Os investigadores também inscreverão um grupo de controle negativo de pacientes saudáveis ​​com ECG basal normal, sem anormalidades estruturais cardíacas e sem qualquer medicamento que possa interferir no MST. Esta população consistirá em parentes de famílias negativas para triagem de SCD inexplicável.

Os critérios de diagnóstico e protocolo de teste serão idênticos aos definidos na tarefa 1.

Três batimentos consecutivos serão usados ​​para cada medição e o valor médio obtido pelos dois investigadores será levado em consideração. O intervalo QT será medido em DII ou V5, desde o início do complexo QRS até o final da onda T (definido como a interseção da tangente da onda T e a linha isoelétrica). A onda U será excluída da medição do intervalo QT.

Este estudo é conduzido de acordo com as diretrizes europeias para pesquisa clínica e genética. A aprovação do protocolo será obtida em comitês de ética institucionais. O consentimento informado por escrito será obtido de cada paciente que concordou em participar do estudo clínico e genético.

As análises estatísticas serão realizadas com o software Social Science® (IBM Corp., Armonk, Nova York). As comparações entre os grupos serão realizadas para cada parâmetro clínico e de ECG no início e durante ambos os testes (teste de estresse mental, teste de exercício, teste de epinefrina). As variáveis ​​categóricas serão apresentadas com seus números e porcentagens. O teste do qui-quadrado ou exato de Fisher (baseado na frequência esperada) será usado para comparar as variáveis ​​categóricas entre os grupos. As variáveis ​​quantitativas serão apresentadas como média ± desvio padrão ou mediana (25º; 75º). A análise das variáveis ​​contínuas será realizada por meio do teste t ou teste de Mann Whitney baseado na distribuição. Um valor P bilateral inferior a 0,05 será considerado para indicar significância estatística em todos os testes.

O investigador já inscreveu no hospital de Nantes uma população de 30 controles saudáveis ​​e 25 indivíduos afetados com SQTL (LQT1=9 ou LQT2=16), mas com um QTc <480 ms em repouso. Os primeiros resultados identificaram uma sensibilidade do teste de esforço, teste de epinefrina e MST respectivamente de 60%, 95% e 94% nas famílias, e 76%, 93% e 92% nos controles positivos, para uma especificidade de 100% alcançada para cada teste. Isso confirma que o teste MST pode ser interessante em pacientes com QT longo com ausência de prolongamento claro do intervalo QT.

Tarefa 3: identificar genes específicos associados à doença

Objetivo: Identificar variantes raras em novos genes que contribuem fortemente para o risco de FV em pedigrees.

Quatro grandes famílias de fertilização in vitro apresentando 6 SCD (com 2 ressuscitados) e 7 episódios de síncope inexplicados ocorrendo em idade jovem foram caracterizados em Nantes. Entre eles, respectivamente 9, 10, 11 e 4 membros da família apresentam intervalo QT prolongado após MST e/ou outro teste provocativo, enquanto todos os genes associados à SQTL foram negativos. A descrição dessa nova entidade clínica foi recentemente aceita para publicação no Journal of the American College of Cardiology17. A ocorrência de anormalidades de FV/DF ou ECG em indivíduos geneticamente distantes dentro de famílias torna os pedigrees altamente poderosos para estudos genéticos, pois quanto maior a distância genética, menos variantes os pacientes compartilharão. Outros parentes dignos de nota serão investigados clinicamente (indivíduo com símbolos de interrogação nos pedigrees abaixo) e podem aumentar o poder do estudo genético. Trabalhos anteriores de J. Barc e do grupo Nantes demonstraram nossa capacidade de liderar projetos tão ambiciosos e especificamente na descoberta de genes com base na abordagem familiar acoplada ao sequenciamento de próxima geração.

tarefa3.1: Genotipagem completa do genoma e análise dos membros afetados da família Objetivo: Identificar uma região genômica compartilhada pelos membros afetados.

A genotipagem de todo o genoma em todos os membros da família afetados será realizada usando a placa Axiom Genome-Wide Human Precision Medicine Research Array (PMRA) no Affymetrix GeneTitan® Multi-Channel, instrumento disponível através da instalação do núcleo genômico de Nantes de nosso laboratório. As regiões genômicas compartilhadas pelos membros da família afetados serão avaliadas pela análise de identidade por descendência (IBD), conforme descrito anteriormente. Esta etapa é crucial para refinar a região do genoma onde a variante causal está localizada. De acordo com o grande tamanho das famílias, os investigadores podem esperar que uma região genômica relativamente pequena surja dessa análise. A atenção será dedicada à potencial região compartilhada entre as famílias que indicaria um potencial gene comum.

tarefa3.2: Sequenciamento e análise do genoma completo Objetivo: identificar variantes raras entre as regiões genômicas compartilhadas pelos membros afetados da família.

Aqui, os investigadores realizarão o sequenciamento do genoma em 3 indivíduos distantemente relacionados afetados pela síndrome CIQTP de cada um dos 4 pedigrees. As vantagens do sequenciamento do genoma residem na ausência de etapas de captura e PCR, limitando fortemente os artefatos de captura, as regiões não cobertas e oferecendo a possibilidade de descobrir uma mutação dentro de um elemento regulatório essencial pertencente à região não codificante. O sequenciamento será realizado em colaboração com o Centro Nacional de Genotipagem (CEA-CNG). O pipeline NGS segue as recomendações do Broad Institute GATK "Best Practices" broadinstitute.org/gatk/guide/best-practices.php. Basicamente, as leituras são mapeadas usando bwa-mem, as duplicatas são removidas usando picard, o GATK é usado para realinhar e recalibrar as leituras. As variantes são chamadas com HaplotypeCaller e recalibradas com GATK. Os VCFs gerados são então anotados com o preditor Ensembl Variant Effect. A partir dos arquivos VCF e dentro de cada heredograma, os investigadores devem priorizar variantes compartilhadas pelos 3 indivíduos afetados e contidas em regiões genômicas compartilhadas (IBD). A partir das variantes compartilhadas, os investigadores devem se concentrar nas variantes raras e, em seguida, filtrar as variantes comuns na população em geral (frequência de alelos menores > 0,1%). Para isso, os investigadores usarão bancos de dados de exoma/genoma públicos e internos, reunindo um total de cerca de 130.000 exomas e 20.000 genomas, como o consórcio gnomaAD, 1000Genomes, o genoma da Holanda e controles demográficos correspondentes especificamente da área de Nantes (estudo PREGO -www.vacarme-project.org). Espera-se que isso resulte em uma pequena lista de poucas variantes/genes "candidatos" por família. Uma predição bioinformática de seu efeito funcional será avaliada pelos programas SIFT e Polyphen2 para destacar variantes malignas putativas entre elas. Os investigadores validarão todas as variantes identificadas dessa forma pelo sequenciamento de Sanger e investigarão sua co-segregação com outros membros da família afetados nos respectivos pedigrees. A experiência das instalações centrais de genômica e bioinformática de Nantes do nosso laboratório, reconhecidas como infraestruturas nacionais francesas em genômica (IBiSA) e bioinformática (Institut Français de Bioinformatique), aliada à nossa experiência em gerenciamento de dados NGS, garantirá a viabilidade desta tarefa. Além disso, um grande projeto de sequenciamento do genoma reunindo mais de 1000 genomas inteiros (incluindo pacientes cardíacos e indivíduos da população em geral) está em andamento em nosso grupo. A experiência deste projeto reforçará a eficiência da análise da tarefa nº 3 e a chance de sucesso.

Tarefa 4: realizar perfil transcriptômico e eletrofisiológico de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas de pacientes CIQTP para identificar biomarcadores putativos e mecanismos fisiopatológicos

Os investigadores formulam a hipótese de que os cardiomiócitos derivados de células estaminais pluripotentes induzidas (iPSC-CMs) gerados a partir de doentes CIQPT permitirão identificar as alterações globais na expressão génica e as alterações eletrofisiológicas associadas à doença. Para isso, os investigadores pretendem comparar iPSC-CMs gerados a partir de membros das 4 famílias descritas na tarefa 3. Dentro de cada heredograma, os investigadores selecionarão um indivíduo saudável "controle" (sem apresentar prolongamento QT familiar) e 2 pacientes CIPQT.

As linhagens de células iPS de controle positivo de QTL e de controle saudável negativo já foram geradas e estudadas em Nantes no contexto de um estudo anterior sobre LQT2 demonstrando a viabilidade dessa tarefa. Isso também oferecerá a oportunidade de comparar a assinatura transcriptômica e eletrofisiológica do CIPQT com as do LTQ2. Para cada linha, foram validados 3 clones de células iPS: todas as linhagens têm cariótipo normal e atendem aos padrões atuais de pluripotência. Os pesquisadores diferenciaram com sucesso as células iPS na linhagem cardíaca, usando um método recentemente descrito baseado na modulação temporal da sinalização Wnt/ß-catenina usando pequenas moléculas. Dados preliminares sugerem que os investigadores podem gerar alta pureza e eficiência de diferenciação cardíaca. Em relação às células iPS do paciente LQT2, os pesquisadores mostraram que a mutação hERG A561P leva a um defeito de tráfego que resulta em corrente IKr reduzida e, conseqüentemente, em prolongamento do potencial de ação e arritmias celulares (pós-despolarizações precoces) .

Após a obtenção e validação de todas as linhagens de células iPS, a primeira etapa do projeto consistirá na identificação do perfil de expressão gênica cardíaca associada ao CIQTP. Para isso, os investigadores usarão cardiomiócitos diferenciados de controle e células iPS derivadas de pacientes (dia 28) para realizar análises de seq de RNA, em colaboração com a instalação principal de genômica de nosso laboratório. Os investigadores também realizarão análises de potencial de ação e corrente iônica de alto rendimento usando patch clamp automatizado e técnicas ópticas (CellOptiq®) em condições basais e após estimulação adrenérgica induzida por drogas. Juntas, essas análises nos fornecerão a primeira identificação do perfil eletrofisiológico associado ao CIQTP em cardiomiócitos humanos. Com esta análise, os investigadores serão capazes de vincular o programa de expressão gênica alterada associada ao CIQTP à fisiologia cardíaca defeituosa.

Protocolos de diferenciação cardíaca iPSC: as células serão cultivadas em uma placa revestida com Matrigel e expostas às citocinas cardiogênicas: CHIR e IWR-1. Colônias pulsantes aparecem após cerca de 10 dias. Após 20 dias, as células serão dissociadas e novamente semeadas para análises eletrofisiológicas, 10 dias depois. Finalmente, após 28 dias de diferenciação, células batendo serão coletadas para análise de seq de RNA.

Sequenciamento de transcriptoma total (RNAseq): batendo iPSC-CMs em 28 dias de 3 diferenciação de 2 clones de cada linhagem de células iPS será coletado e o RNA será extraído usando o kit Macherey-Nagel. A presença e a quantidade de cada RNA das amostras serão então avaliadas usando sequenciamento de próxima geração (tecnologia Illumina HiSeq). A análise de bioinformática será realizada pela instalação central BIRD de nosso laboratório.

Registros de corrente iônica por patch clamp automatizado: os defeitos de repolarização do CIQTP provavelmente refletem a disfunção de correntes iônicas específicas que serão registradas usando patch-clamp de células inteiras: corrente de sódio, INa, corrente de cálcio, ICa, L e correntes de potássio, IKs e IKr.

Gravação do potencial de ação: Esta gravação será realizada usando 2 técnicas.

1. Células espancadoras isoladas serão analisadas pela técnica de patch-clamp perfurado com anfotericina B a 37oC. As pipetas adesivas serão preenchidas com uma solução de composição iônica semelhante ao fluido intracelular.
2. Registros ópticos de potencial de ação serão realizados em cardiomiócitos após 28 dias de diferenciação, com 5 µmol/L di-8-ANEPPS como corante sensível à voltagem usando a tecnologia CellOptiq® (Clyde Biosciences). As células serão incubadas a 37°C, 5% CO2 e 20% O2 durante as 2 h de incubação do corante e durante o registro.