Przedłużenie CIQTP: rola i mechanizm nagłej śmierci sercowej (IQARE-SCD)

Nagła śmierć sercowa (SCD) jest główną przyczyną zgonów w krajach rozwiniętych. Szacuje się, że każdego roku we Francji nagle umiera od 40 000 do 50 000 osób. Większość tych zgonów dotyczy osób starszych i jest związana z chorobą wieńcową. Jednak szacuje się, że każdego roku we Francji nagle umiera od 4000 do 5000 osób w wieku od 1 do 45 lat. SCD często występuje u młodych ofiar bez możliwych do zidentyfikowania nieprawidłowości w EKG i bez wad strukturalnych. W konsekwencji większość zdarzeń SCD u młodych dorosłych pozostaje niewyjaśniona i zalicza się je do nieuchwytnej grupy znanej jako idiopatyczne migotanie komór (IVF).

Badacz niedawno zidentyfikował nową jednostkę arytmii (wydłużenie odstępu QT wywołane katecholaminami; CIQTP) odpowiedzialną za SCD i charakteryzującą się prawidłowym czasem trwania odstępu QT w spoczynku, ale znacznym wydłużeniem odstępu QT podczas próby wysiłkowej. Celem tego translacyjnego projektu jest określenie częstości występowania tego nowego fenotypu rzadkiej choroby w niewyjaśnionym SCD i zidentyfikowanie leżącego u jego podstaw mechanizmu patofizjologicznego.

Zastosowanie testu obciążenia psychicznego można rozszerzyć na inne dziedziczne choroby arytmiczne, takie jak zespół wydłużonego odstępu QT. Biorąc pod uwagę możliwość identyfikacji nowych chorych krewnych, może to prowadzić do znacznego zmniejszenia ryzyka nawrotu nagłego zgonu sercowego w rodzinie.

Głównym zagadnieniem tego projektu jest opisanie implikacji klinicznych i mechanizmu patofizjologicznego tego nowego zespołu prowadzącego do SCD.

Na podstawie naszego niedawnego opisu tego wydłużenia odstępu QT wywołanego przez katecholaminy, badacze postawili hipotezę, że:

• Zespół ten jest częściowo związany z 60% niezdiagnozowanych przypadków rodzinnego zapłodnienia in vitro po przeprowadzeniu pełnego rodzinnego badania przesiewowego7. Rzeczywiście, ponieważ wyjściowe EKG jest prawidłowe bez MST, identyfikację takich cech klinicznych można przeprowadzić za pomocą testu stresu psychicznego u probanda i krewnych, którzy wcześniej uważali, że nie mają dziedzicznej choroby arytmii.
• Test stresu psychicznego pomoże zidentyfikować graniczne przypadki innych dziedzicznych zaburzeń rytmu, takich jak zespół wydłużonego QT. Rzeczywiście, ta dziedziczna arytmia charakteryzuje się uwarunkowanym genetycznie wydłużeniem odstępu QT obserwowanym w wyjściowym zapisie EKG, jednak ponad jedna trzecia pacjentów ma jedynie nieznaczne wydłużenie odstępu QT na początku badania. W związku z tym wymagają zastosowania testów prowokacyjnych (np. próba wysiłkowa i test z adrenaliną) w celu ujawnienia patologicznego wydłużenia odstępu QT18. Badacz wysuwa hipotezę, że MST może pomóc w zdemaskowaniu tego wydłużenia odstępu QT.
• Opierając się na niedawno opisanym przez badacza trybie dziedziczenia autosomalnego dla tej choroby, badacz postawił hipotezę, że zespół ten należy do zaburzeń mendlowskich. Dlatego badacze proponują zastosowanie podejścia rodzinnego w celu zidentyfikowania głównych genów związanych z zespołem CIQTP.

Celem tego projektu jest opisanie implikacji klinicznych i mechanizmu patofizjologicznego tego nowego zespołu prowadzącego do nagłej śmierci sercowej. W szczególności śledczy mają na celu:

• określić częstość występowania CIQTP w niewyjaśnionych SCD i zidentyfikować nowe duże rodziny dotknięte chorobą
• określić rolę stresu psychicznego w wydłużeniu odstępu QT
• zidentyfikować geny powiązane z chorobą, łącząc sekwencjonowanie całego genomu i analizę tożsamości przez pochodzenie w dużych rodzinach
• wykonać profilowanie transkryptomiczne i elektrofizjologiczne indukowanych kardiomiocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC-CM) od pacjentów z CIQTP w celu identyfikacji przypuszczalnych biomarkerów i mechanizmów patofizjologicznych.

W oparciu o to podejście translacyjne, badacze zamierzają opisać patofizjologię i kliniczne implikacje CIQTP w nagłej śmierci sercowej. Opis tego nowego zespołu przy użyciu nowatorskich metod, takich jak sekwencjonowanie całego genomu i profilowanie iPSC-CM, może zapewnić wszechstronny i znaczący postęp w dziedzinie niewyjaśnionych SCD. Poza identyfikacją i opieką nad nowo dotkniętymi krewnymi, może pomóc w zdefiniowaniu terapii opartej na genetyce/patofizjologii.

Badacze udowodnili już, że MST jest bardzo skutecznym narzędziem diagnostycznym do wykrywania tego nowego zespołu i uważają, że może również pomóc w zdemaskowaniu wydłużenia odstępu QT u nosicieli cichej mutacji LQTS. MST ma tę zaletę, że jest szybki i prosty w zastosowaniu. Dlatego bardzo interesujące może być odkrycie rodzinnej segregacji niewyjaśnionych defektów elektrycznych serca wykazujących autosomalną dominującą transmisję. Mogłoby to dodatkowo zmniejszyć widoczny brak penetracji występujący w LQTS.

Zadania projektu

Zadanie 1: określić częstość występowania CIQTP w niewyjaśnionych SCD i zidentyfikować nowe dotknięte nimi rodziny

Większość przypadków SCD przed 45 rokiem życia pozostaje niewyjaśniona i prawdopodobnie jest spowodowana wrodzoną chorobą arytmiczną6. Po niewyjaśnionym SCD, badaniem zostaną objęte wszystkie kolejne rodziny kierowane do szpitali uniwersyteckich w Nantes, Rennes, Tours lub Brest.

Wszystkie dostępne dane dotyczące prób klinicznych zostaną zebrane od lekarzy kierujących i krewnych. Po wykonaniu sekcji zwłok probanci, których diagnoza będzie możliwa do uzyskania, zostaną wykluczeni z badania.

Rodzinne badanie przesiewowe Po niewyjaśnionym SCD przed 45 rokiem życia, rodzinne badanie przesiewowe zostanie przeprowadzone u krewnych pierwszego stopnia, a następnie rozszerzone na innych krewnych, jeśli wynik będzie dodatni. Gdy krewni pierwszego stopnia nie są dostępni do badania przesiewowego, zostanie ono przeprowadzone u dalszych krewnych.

Kliniczne badanie przesiewowe będzie obejmować przegląd wcześniejszej historii medycznej, badanie kliniczne i wyjściowe EKG. W przypadku braku rozpoznania po tym pierwszym zestawie badań, należy wykonać próbę wysiłkową, echokardiogram przezklatkowy (TTE), prowokację blokerem kanału sodowego (SCBC) z ajmaliną (1 mg/kg) lub flekainidem (2 mg/kg) oraz test epinefryny23, odbędzie się 24. Dodatkowo zostanie przeprowadzony test obciążenia psychicznego w celu ujawnienia wydłużenia odstępu QT z normalnym wyjściowym EKG 25.

Protokół testu stresu psychicznego (załącznik 2) MST zostanie przeprowadzony w następujący sposób. Pacjenci zostaną ułożeni w pozycji leżącej bez wyjaśnienia przebiegu badania. EKG zostanie zarejestrowane na początku badania i na stałe podczas badania. MST zostanie następnie przeprowadzony w trybie nagłym, zgodnie z poziomem wykształcenia pacjenta (arytmetyka umysłowa, geografia lub imiona postaci Disneya dla dzieci) z wymogiem poprawnych i szybkich odpowiedzi. MST zostanie uznane za istotne w przypadku wzrostu częstości akcji serca o co najmniej 20 uderzeń na minutę. W przypadku braku wzrostu częstości akcji serca o 20 uderzeń na minutę, test zostanie uznany za niemożliwy do interpretacji, chyba że zostanie stwierdzone znaczne wydłużenie odstępu QTc. MST zwykle trwa krócej niż 2 minuty. Nowe EKG zostanie zarejestrowane 30 minut po zakończeniu testu w celu uzyskania zapisu EKG z najniższą częstością akcji serca.

Diagnoza

EKG wykonane na początku badania, podczas testu wysiłkowego i podczas testu farmakologicznego zostanie ocenione przez dwóch lekarzy nie znających stanu klinicznego i genetycznego. Wszystkie dane będą gromadzone w podstawowej bazie danych.

Kryteria rozpoznania były zgodne z wytycznymi ostatniej konferencji konsensusu24,26. Badacze dodatkowo wezmą pod uwagę delta QTm > 30 ms podczas epinefryny lub testu wysiłkowego oraz delta QTc > 30 ms 3 min po teście wysiłkowym jako wystarczające do rozpoznania LQTS 27,28.

Pomiędzy każdym testem zachowana zostanie minimalna przerwa wynosząca 30 minut, aby umożliwić klirens katecholamin. Wszystkie badania będą wykonywane co najmniej 5 dni po przerwaniu każdego leczenia, które mogłoby zakłócić badania.

Niniejsze badanie jest prowadzone zgodnie z europejskimi wytycznymi dotyczącymi badań klinicznych i genetycznych. Zatwierdzenie protokołu zostanie uzyskane od instytucjonalnych komisji etycznych. Świadoma pisemna zgoda zostanie uzyskana od każdego pacjenta, który wyraził zgodę na udział w badaniu klinicznym i genetycznym.

Analiza statystyczna Analizy statystyczne zostaną przeprowadzone za pomocą oprogramowania Social Science® (IBM Corp., Armonk, Nowy Jork). Przedstawione zostaną zmienne kategoryczne wraz z ich liczbami i procentami. Do porównania zmiennych kategorycznych między grupami zostanie wykorzystany test chi-kwadrat lub dokładny test Fishera (oparty na oczekiwanej częstości).

Zmienne ilościowe zostaną przedstawione jako średnia ± odchylenie standardowe lub mediana (25.; 75.). Analiza zmiennych ciągłych zostanie przeprowadzona za pomocą testu t lub testu Manna Whitneya opartego na rozkładzie. Porównania między rodzinami zostaną przeprowadzone przy użyciu średniej wartości wewnątrzrodzinnej lub mediany zmiennej ciągłej, aby ograniczyć błąd w kierunku wielkości rodziny. Dwustronna wartość P mniejsza niż 0,05 będzie uważana za wskazującą istotność statystyczną we wszystkich testach.

Zadanie 2: określić rolę stresu psychicznego w wydłużeniu odstępu QT

Aby określić rolę stresu psychicznego w wydłużeniu odstępu QT, badacze dodatkowo włączą pozytywne i negatywne grupy kontrolne w szpitalach uniwersyteckich w Nantes, Rennes, Tours lub Brest.

Polegać to będzie na włączeniu kolejnych krewnych rodzin dotkniętych zespołem wydłużonego odstępu QT bez wyjściowego wydłużenia odstępu QT. Wynik tego testu zostanie porównany z konwencjonalnym badaniem przesiewowym za pomocą testu wysiłkowego i testu epinefryny. Tym samym badacze dążą do włączenia pacjentów dalej zdefiniowanych jako nosiciele głównych genetycznych form zespołu wydłużonego odstępu QT (LQT1, LQT2 i LQT3, grupa kontroli pozytywnej).

Badacze dodatkowo włączą grupę kontrolną ujemną składającą się ze zdrowych pacjentów z prawidłowym wyjściowym EKG, bez nieprawidłowości strukturalnych serca i bez żadnych leków, które mogłyby zakłócać MST. Ta populacja będzie składać się z krewnych rodzin z ujemnym wynikiem niewyjaśnionych badań przesiewowych SCD.

Kryteria diagnozy i protokół badania będą identyczne jak w zadaniu 1.

Do każdego pomiaru zostaną użyte trzy kolejne uderzenia, a pod uwagę zostanie wzięta średnia wartość uzyskana przez dwóch badaczy. Odstęp QT będzie mierzony w DII lub V5, od początku zespołu QRS do końca załamka T (definiowanego jako przecięcie stycznej załamka T i linii izoelektrycznej). Załamek U zostanie wykluczony z pomiaru odstępu QT.

Niniejsze badanie jest prowadzone zgodnie z europejskimi wytycznymi dotyczącymi badań klinicznych i genetycznych. Zatwierdzenie protokołu zostanie uzyskane od instytucjonalnych komisji etycznych. Świadoma pisemna zgoda zostanie uzyskana od każdego pacjenta, który wyraził zgodę na udział w badaniu klinicznym i genetycznym.

Analizy statystyczne zostaną przeprowadzone za pomocą oprogramowania Social Science® (IBM Corp., Armonk, Nowy Jork). Porównania między grupami zostaną przeprowadzone dla każdego parametru klinicznego i EKG na początku badania oraz podczas obu testów (próba obciążenia psychicznego, próba wysiłkowa, próba epinefryny). Przedstawione zostaną zmienne kategoryczne wraz z ich liczbami i procentami. Do porównania zmiennych kategorycznych między grupami zostanie wykorzystany test chi-kwadrat lub dokładny test Fishera (oparty na oczekiwanej częstości). Zmienne ilościowe zostaną przedstawione jako średnia ± odchylenie standardowe lub mediana (25.; 75.). Analiza zmiennych ciągłych zostanie przeprowadzona za pomocą testu t lub testu Manna Whitneya opartego na rozkładzie. Dwustronna wartość P mniejsza niż 0,05 będzie uważana za wskazującą istotność statystyczną we wszystkich testach.

Badacz zarejestrował już w szpitalu w Nantes populację 30 zdrowych osób z grupy kontrolnej i 25 osób dotkniętych LQTS (LQT1=9 lub LQT2=16), ale ze spoczynkowym odstępem QTc <480 ms. Pierwsze wyniki wykazały czułość testu wysiłkowego, testu epinefryny i MST odpowiednio na poziomie 60%, 95% i 94% w obrębie rodzin oraz 76%, 93% i 92% w ramach kontroli pozytywnych, przy swoistości sięgającej 100% dla każdy test. Potwierdza to, że test MST może być interesujący u pacjentów z długim odstępem QT, u których nie stwierdza się wyraźnego wydłużenia odstępu QT.

Zadanie 3: zidentyfikuj określone geny związane z chorobą

Cel: Identyfikacja rzadkich wariantów w nowych genach silnie przyczyniających się do ryzyka VF w rodowodach.

W Nantes scharakteryzowano cztery duże rodziny IVF, w których wystąpiło 6 SCD (w tym 2 resuscytowane) i 7 niewyjaśnionych epizodów omdleń występujących w młodym wieku. Wśród nich odpowiednio 9, 10, 11 i 4 członków rodziny wykazuje wydłużony odstęp QT po MST i/lub innym teście prowokacyjnym, podczas gdy wszystkie geny związane z LQTS były ujemne. Opis tej nowej jednostki klinicznej został niedawno przyjęty do publikacji w Journal of the American College of Cardiology17. Występowanie nieprawidłowości VF/SCD lub EKG u genetycznie odległych osobników w obrębie rodziny sprawia, że ​​rodowody są bardzo przydatne w badaniach genetycznych, ponieważ im większa odległość genetyczna, tym mniej wariantów będą wspólne dla pacjentów. Warto zauważyć, że dodatkowi krewni zostaną zbadani klinicznie (osobnik z symbolami znaku zapytania w rodowodach poniżej) i mogą zwiększyć moc badań genetycznych. Poprzednie prace J. Barca i grupy Nantes pokazały naszą zdolność do prowadzenia tak ambitnych projektów, a konkretnie w zakresie odkrywania genów w oparciu o podejście rodzinne połączone z sekwencjonowaniem nowej generacji.

zadanie 3.1: Genotypowanie i analiza całego genomu członków rodziny dotkniętych chorobą Cel: Zidentyfikować region genomowy wspólny dla członków rodziny dotkniętych chorobą.

Genotypowanie całego genomu wszystkich dotkniętych chorobą członków rodziny zostanie przeprowadzone przy użyciu płytki Axiom Genome-Wide Human Precision Medicine Research Array (PMRA) na Affymetrix GeneTitan® Multi-Channel, instrumencie dostępnym w centrum genomicznym naszego laboratorium w Nantes. Regiony genomu wspólne dla członków rodziny dotkniętych chorobą zostaną ocenione za pomocą analizy Identity By Descent (IBD), jak opisano wcześniej. Ten krok ma kluczowe znaczenie dla udoskonalenia regionu genomu, w którym znajduje się wariant przyczynowy. Biorąc pod uwagę dużą liczebność rodzin, badacze mogą spodziewać się, że z tej analizy wyłoni się stosunkowo mały region genomowy. Uwaga zostanie poświęcona potencjalnie wspólnemu regionowi wśród rodzin, który wskazywałby na potencjalny wspólny gen.

zadanie 3.2: Sekwencjonowanie i analiza całego genomu Cel: zidentyfikować rzadkie warianty wśród regionów genomowych wspólnych dla dotkniętych chorobą członków rodziny.

Tutaj badacze przeprowadzą sekwencjonowanie genomu u 3 daleko spokrewnionych osobników dotkniętych zespołem CIQTP z każdego z 4 rodowodów. Zalety sekwencjonowania genomu polegają na braku etapów wychwytywania i PCR, co znacznie ogranicza wychwytywanie artefaktów, regionów nieobjętych i oferuje możliwość odkrycia mutacji w obrębie podstawowego elementu regulatorowego należącego do regionu niekodującego. Sekwencjonowanie zostanie przeprowadzone we współpracy z National Genotyping Center (CEA-CNG). Rurociąg NGS jest zgodny z zaleceniami Broad Institute GATK „Best Practices” broadinstitute.org/gatk/guide/best-practices.php. Zasadniczo odczyty są mapowane za pomocą bwa-mem, Duplikaty są usuwane za pomocą picard, GATK służy do ponownego wyrównania i ponownej kalibracji odczytów. Warianty są wywoływane za pomocą HaplotypeCaller i są ponownie kalibrowane za pomocą GATK. Wygenerowane VCF są następnie opatrzone adnotacjami za pomocą predyktora Ensembl Variant Effect. Z plików VCF iw obrębie każdego rodowodu badacze ustalają priorytety dla wariantów wspólnych dla 3 dotkniętych osobników i zawartych we wspólnych regionach genomowych (IBD). Spośród wspólnych wariantów badacze skupią się na rzadkich wariantach, a następnie odfiltrują warianty, które są powszechne w populacji ogólnej (częstość mniejszych alleli > 0,1%). W tym celu badacze wykorzystają publiczne i wewnętrzne bazy danych egzomów/genomów, gromadzące łącznie około 130 000 egzomów i 20 000 genomów, takie jak konsorcjum The gnomAD, 1000Genomes, the Genome of the Netherlands oraz dopasowane pod względem demograficznym kontrole z obszaru Nantes (badanie PREEGO -www.vacarme-project.org). Oczekuje się, że doprowadzi to do powstania krótkiej listy kilku „kandydatów” wariantów/genów na rodzinę. Prognozy bioinformatyczne dotyczące ich efektu funkcjonalnego zostaną ocenione przez programy SIFT i Polyphen2 w celu wyróżnienia wśród nich domniemanych wariantów złośliwych. Badacze zweryfikują wszystkie warianty zidentyfikowane w ten sposób przez sekwencjonowanie Sangera i zbadają ich współsegregację z innymi dotkniętymi członkami rodziny w odpowiednich rodowodach. Doświadczenie głównego ośrodka genomiki i bioinformatyki w Nantes naszego laboratorium, które są uznawane za francuską krajową infrastrukturę genomiki (IBiSA) i bioinformatyki (Institut Français de Bioinformatique) w połączeniu z naszym doświadczeniem w zarządzaniu danymi NGS zapewni wykonalność tego zadania. Ponadto w naszej grupie trwa duży projekt sekwencjonowania genomu obejmujący ponad 1000 całych genomów (w tym pacjentów kardiologicznych i osoby z populacji ogólnej). Doświadczenia z tego projektu wzmocnią efektywność analizy zadania nr 3 i szanse powodzenia.

Zadanie 4: wykonać profilowanie transkryptomiczne i elektrofizjologiczne indukowanych kardiomiocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych od pacjentów z CIQTP w celu identyfikacji przypuszczalnych biomarkerów i mechanizmów patofizjologicznych

Badacze stawiają hipotezę, że indukowane kardiomiocyty pochodzące z pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC-CM) uzyskane od pacjentów z CIQPT pozwolą nam zidentyfikować globalne zmiany ekspresji genów i zmiany elektrofizjologiczne związane z chorobą. W tym celu badacze mają na celu porównanie iPSC-CM wygenerowanych od członków 4 rodzin opisanych w zadaniu 3. W ramach każdego rodowodu badacze wybiorą jednego „kontrolnego” zdrowego osobnika (nie wykazującego rodzinnego wydłużenia odstępu QT) i 2 pacjentów z CIPQT.

Pozytywna kontrola LQT i negatywna kontrola zdrowych linii komórkowych iPS zostały już wygenerowane i zbadane w Nantes w kontekście poprzedniego badania LQT2, które wykazało wykonalność tego zadania. Da to również możliwość porównania sygnatury transkryptomicznej i elektrofizjologicznej CIPQT z sygnaturami LTQ2. Dla każdej linii zwalidowano 3 klony komórek iPS: wszystkie linie mają prawidłowy kariotyp i spełniają aktualne standardy pluripotencji. Badacze z powodzeniem różnicowali komórki iPS w linię sercową, stosując niedawno opisaną metodę opartą na czasowej modulacji sygnalizacji Wnt/ß-kateniny przy użyciu małych cząsteczek. Wstępne dane sugerują, że badacze mogą uzyskać wysoką czystość i wydajność różnicowania serca. Jeśli chodzi o komórki iPS od pacjenta z LQT2, badacze wykazali, że mutacja hERG A561P prowadzi do defektu przemytu, który skutkuje zmniejszonym prądem IKr, aw konsekwencji e do wydłużenia potencjału czynnościowego i komórkowych zaburzeń rytmu (wczesne depolaryzacje).

Po uzyskaniu i walidacji wszystkich linii komórkowych iPS pierwszym etapem projektu będzie identyfikacja profilu ekspresji genów sercowych związanych z CIQTP. W tym celu badacze wykorzystają kardiomiocyty zróżnicowane z kontrolnych i pochodzących od pacjentów komórek iPS (dzień 28) do przeprowadzenia analiz seq RNA we współpracy z głównym ośrodkiem Genomics naszego laboratorium. Badacze przeprowadzą również wysokowydajne analizy potencjału czynnościowego i prądu jonowego przy użyciu zautomatyzowanych technik patch clamp i technik optycznych (CellOptiq®) w warunkach wyjściowych i po wywołanej lekami stymulacji adrenergicznej. Wszystkie te analizy dostarczą nam pierwszej identyfikacji profilu elektrofizjologicznego związanego z CIQTP w ludzkich kardiomiocytach. Dzięki tej analizie badacze będą mogli powiązać program ekspresji zmienionego genu związany z CIQTP z wadliwą fizjologią serca.

Protokoły różnicowania serca iPSC: komórki będą hodowane na płytce pokrytej Matrigelem i eksponowane na cytokiny kardiogenne: CHIR i IWR-1. Bijące kolonie pojawiają się po około 10 dniach. Po 20 dniach komórki zostaną oddzielone i ponownie wysiane do analiz elektrofizjologicznych, 10 dni później. Wreszcie, po 28 dniach różnicowania, bijące komórki zostaną zebrane do analizy sekwencji RNA.

Sekwencjonowanie całego transkryptomu (RNAseq): pobicie iPSC-CM po 28 dniach 3 różnicowania z 2 klonów każdej linii komórkowej iPS zostanie zebrane i RNA zostanie wyekstrahowane przy użyciu zestawu Macherey-Nagel. Obecność i ilość każdego RNA w próbkach zostanie następnie oceniona przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji (technologia Illumina HiSeq). Analiza bioinformatyczna zostanie przeprowadzona przez główny ośrodek BIRD naszego laboratorium.

Rejestracje prądu jonowego za pomocą zautomatyzowanego patch-clamp: defekty repolaryzacji CIQTP prawdopodobnie odzwierciedlają dysfunkcję określonych prądów jonowych, które będą rejestrowane przy użyciu patch-clamp całej komórki: prąd sodowy, INa, prąd wapniowy, ICa,L i prądy potasowe, IKs i IKr.

Rejestracja potencjału czynnościowego: To nagranie zostanie wykonane przy użyciu 2 technik.

1. Wyizolowane komórki bijące będą analizowane przy użyciu techniki perforowanej plastra-zacisku z amfoterycyną B w temperaturze 37oC. Pipety krosowe zostaną wypełnione roztworem, który ma skład jonowy podobny do płynu wewnątrzkomórkowego.
2. Optyczny zapis potencjału czynnościowego zostanie wykonany na kardiomiocytach po 28 dniach różnicowania, przy użyciu 5 µmol/l di-8-ANEPPS jako barwnika czułego na napięcie, przy użyciu technologii CellOptiq® (Clyde Biosciences). Komórki będą inkubowane w 37°C, 5% CO2 i 20% O2 podczas 2-godzinnej inkubacji barwnika i podczas rejestracji.