CIQTP-förlängning: roll och mekanism vid plötslig hjärtdöd (IQARE-SCD)

Plötslig hjärtdöd (SCD) är en viktig dödsorsak i utvecklade länder. Uppskattningsvis dör 40 000 till 50 000 individer plötsligt varje år i Frankrike. De flesta av dessa dödsfall involverar äldre människor och är relaterade till kranskärlssjukdom. Uppskattningsvis dör dock uppskattningsvis 4000 till 5000 individer mellan 1 och 45 år plötsligt varje år i Frankrike. SCD förekommer ofta hos unga offer utan identifierbara EKG-avvikelser och utan strukturella defekter. Följaktligen förblir de flesta SCD-händelser hos den unga vuxna oförklarade och klassificeras i en svårfångad grupp som kallas idiopatisk ventrikulär fibrillering (IVF).

Utredaren identifierade nyligen en ny arytmisk enhet (katekolamininducerad QT-förlängning; CIQTP) ansvarig för SCD och kännetecknas av normal QT-längd i vila men betydande QT-förlängning under mental stresstest. Syftet med detta translationella projekt är att fastställa prevalensen av denna nya fenotyp av sällsynt sjukdom i oförklarad SCD och identifiera dess underliggande patofysiologiska mekanism.

Användningen av mental stresstest skulle kunna utvidgas till andra ärftliga arytmiska sjukdomar såsom långt QT-syndrom. Med tanke på potentialen för identifiering av nya drabbade släktingar kan det leda till en betydande minskning av risken för plötslig hjärtdöd i en familj.

Huvudfrågan för detta projekt är att beskriva den kliniska implikationen och den patofysiologiska mekanismen för detta nya syndrom som leder till SCD.

Baserat på vår senaste beskrivning av denna katekolamininducerade QT-förlängning, antar utredarna att:

• Detta syndrom är delvis involverat i 60 % av odiagnostiserad familjär IVF efter fullständig familjär screening7. Eftersom baslinje-EKG:t är normalt utan MST, kan identifiering av sådana kliniska särdrag utföras genom mentalt stresstest hos proband och släktingar som tidigare ansetts vara opåverkade av ärftlig arytmisk sjukdom.
• Mentalt stresstest kommer att hjälpa till att identifiera gränsfall av andra ärftliga arytmier såsom långt QT-syndrom. Denna ärftliga arytmi kännetecknas faktiskt av en genetiskt baserad förlängning av QT-intervallet som observerats på baslinje-EKG:et, men mer än en tredjedel av patienterna uppvisar endast en lätt QT-förlängning vid baslinjen. Följaktligen kräver de användning av provokationstester (t.ex. träningstest och adrenalintest) för att avslöja patologisk QT-förlängning18. Utredaren antar att MST kan hjälpa till att avslöja denna QT-förlängning.
• Baserat på den autosomala nedärvningsutredaren som nyligen beskrevs för denna sjukdom, antar utredaren att detta syndrom tillhör de mendelska sjukdomarna. Därför föreslår utredarna att tillämpa ett familjebaserat tillvägagångssätt för att identifiera de viktigaste generna som är associerade med CIQTP-syndromet.

Omfattningen av detta projekt är att beskriva den kliniska implikationen och den patofysiologiska mekanismen för detta nya syndrom som leder till plötslig hjärtdöd. Mer specifikt syftar utredarna till att:

• fastställa prevalensen av CIQTP i oförklarad SCD och identifiera nya stora drabbade familjer
• identifiera rollen av mental stress vid QT-förlängning
• identifiera associerade gener med sjukdomen genom att kombinera helgenomsekvensering och Identity By Descent-analys i stora familjer
• utföra transkriptomisk och elektrofysiologisk profilering av inducerade pluripotenta stamcellshärledda kardiomyocyter (iPSC-CM) från CIQTP-patienter för att identifiera förmodade biomarkörer och patofysiologiska mekanismer.

Baserat på detta translationella tillvägagångssätt, syftar utredarna till att beskriva patofysiologi och kliniska implikationer av CIQTP vid plötslig hjärtdöd. Beskrivningen av detta nya syndrom med hjälp av innovativa metoder såsom helgenomsekvensering och iPSC-CM-profilering kan ge ett omfattande och stort framsteg inom området oförklarad SCD. Utöver identifieringen och vården av nyligen drabbade släktingar kan det hjälpa till att definiera en genetisk/patofysiologisk terapi.

Utredarna har redan bevisat att MST är ett mycket effektivt diagnostiskt verktyg för att upptäcka detta nya syndrom, och utredarna tror att det också kan hjälpa till att avslöja QT-förlängning hos tysta LQTS-mutationsbärare. MST har fördelen att vara snabb och enkel att applicera. Det kan därför vara av stort intresse att avslöja familjär segregation för oförklarade elektriska hjärtfel som visar autosomal dominant transmission. Det kan dessutom minska den uppenbara icke-penetrans som uppstår i LQTS.

Projektets uppgifter

Uppgift 1: bestämma prevalensen av CIQTP i oförklarad SCD och identifiera nya drabbade familjer

De flesta fall av SCD före 45 års ålder förblir oförklarade och beror sannolikt på ärftlig arytmisk sjukdom6. Efter oförklarad SCD kommer alla på varandra följande familjer som hänvisas till Nantes, Rennes, Tours eller Brest University Hospital att inkluderas i studien.

Alla tillgängliga kliniska probanddata kommer att samlas in från remitterande läkare och anhöriga. När obduktion utförs kommer de proband vars diagnos kommer att kunna uppnås att uteslutas från studien.

Familjescreening Efter oförklarad SCD före 45 års ålder kommer familjescreening att utföras på första gradens släktingar och sedan utökas till andra släktingar om positivt. När första gradens släktingar inte är tillgängliga för screening kommer det att utföras i mer avlägsna släktingar.

Klinisk screening kommer att innefatta en genomgång av tidigare medicinsk historia, klinisk undersökning och baslinje-EKG. I avsaknad av diagnos efter denna första uppsättning undersökningar, stresstest, transtorakalt ekokardiogram (TTE), natriumkanalblockerare (SCBC) antingen med ajmalin (1 mg/kg) eller flekainid (2 mg/kg) och ett epinefrintest23, 24 kommer att utföras. Mentalt stresstest kommer dessutom att utföras för att avslöja QT-förlängning med normalt baslinje-EKG 25.

Protokoll för mental stresstest (bilaga 2) MST kommer att utföras enligt följande. Patienterna kommer att placeras i ryggläge utan någon förklaring om testförloppet. EKG kommer att registreras vid baslinjen och permanent under testet. MST kommer sedan att utföras abrupt enligt patientens utbildningsnivå (huvudräkning, geografi eller namn på Disneykaraktärer för barn) med krav på korrekta och snabba svar. MST kommer att betraktas som relevant i närvaro av en ökning av hjärtfrekvensen med minst 20 slag per minut. I händelse av frånvaro av en ökning av hjärtfrekvensen med 20 slag per minut, kommer testet att betraktas som icke-tolkbart om inte en signifikant förlängning av QTc identifieras. MST varar vanligtvis mindre än 2 minuter. Ett nytt EKG kommer att registreras 30 minuter efter slutet av testet i ett försök att få ett EKG-spår med den lägsta hjärtfrekvensen.

Diagnos

EKG som utförs vid baslinjen, under stresstestet och under det farmakologiska testet kommer att granskas av två läkare som är blinda för den kliniska och genetiska statusen. All data kommer att samlas in i en kärndatabas.

Diagnoskriterierna följde riktlinjerna från den senaste konsensuskonferensen24,26. Utredarna kommer dessutom att överväga ett delta QTm > 30 ms under epinefrin eller det mentala stresstestet och ett delta QTc > 30 ms 3 minuter efter stresstestet, som tillräckligt för diagnos av LQTS 27,28.

Ett minsta intervall på 30 minuter mellan varje test kommer att observeras för att möjliggöra katekolaminclearance. Alla tester kommer att utföras minst 5 dagar efter att varje behandling avbrutits som kan störa testerna.

Denna studie genomförs enligt europeiska riktlinjer för klinisk och genetisk forskning. Protokollgodkännande kommer att erhållas från institutionella etiska kommittéer. Informerat skriftligt medgivande kommer att erhållas från varje patient som gick med på att delta i den kliniska och genetiska studien.

Statistisk analys Statistiska analyser kommer att utföras med programvaran Social Science® (IBM Corp., Armonk, New York). Kategoriska variabler kommer att presenteras med deras antal och procentsatser. Chi-kvadrat- eller Fishers exakta test (baserat på förväntad frekvens) kommer att användas för att jämföra kategoriska variabler mellan grupper.

Kvantitativa variabler kommer att presenteras som medelvärde ± standardavvikelse eller median (25:e; 75:e). Analys av kontinuerliga variabler kommer att utföras med ett t-test eller Mann Whitney-test baserat på distribution. Jämförelser mellan familjer kommer att utföras med användning av intrafamiliellt medelvärde eller median av kontinuerlig variabel för att begränsa fördomen mot familjestorlek. Ett dubbelsidigt P-värde på mindre än 0,05 kommer att anses indikera statistisk signifikans i alla tester.

Uppgift 2: identifiera rollen av mental stress vid QT-förlängning

För att identifiera rollen av mental stress vid QT-förlängning kommer utredarna dessutom att registrera positiva och negativa kontrollgrupper på universitetssjukhusen i Nantes, Rennes, Tours eller Brest.

Detta kommer att bestå i inskrivningen av på varandra följande släktingar till familjer som drabbats av långt QT-syndrom utan QT-förlängning vid baslinjen. Resultatet av detta test kommer att jämföras med konventionell screening med träningstest och epinefrintest. Därmed syftar utredarna till att registrera patienter som vidare definieras som bärare av de huvudsakliga genetiskt baserade formerna av långt QT-syndrom (LQT1, LQT2 och LQT3, positiv kontrollgrupp).

Utredarna kommer dessutom att registrera en negativ kontrollgrupp av friska patienter med normalt baslinje-EKG, inga strukturella avvikelser i hjärtat och utan någon medicin som kan störa MST. Denna population kommer att bestå av släktingar till familjer som är negativa för oförklarad SCD-screening.

Diagnoskriterier och testprotokoll kommer att vara identiska med de som definieras i uppgift 1.

Tre på varandra följande slag kommer att användas för varje mätning och medelvärdet som erhållits av de två utredarna kommer att tas med i beräkningen. QT-intervall kommer att mätas i DII eller V5, från början av QRS-komplexet till slutet av T-vågen (definierad som skärningspunkten mellan tangenten för T-vågen och den isoelektriska linjen). U-våg kommer att exkluderas från mätningen av QT-intervallet.

Denna studie genomförs enligt europeiska riktlinjer för klinisk och genetisk forskning. Protokollgodkännande kommer att erhållas från institutionella etiska kommittéer. Informerat skriftligt medgivande kommer att erhållas från varje patient som gick med på att delta i den kliniska och genetiska studien.

Statistiska analyser kommer att utföras med programvaran Social Science® (IBM Corp., Armonk, New York). Jämförelser mellan grupper kommer att göras för varje klinisk parameter och EKG-parameter vid baslinjen och under båda testerna (mentalt stresstest, ansträngningstest, adrenalintest). Kategoriska variabler kommer att presenteras med deras antal och procentsatser. Chi-kvadrat- eller Fishers exakta test (baserat på förväntad frekvens) kommer att användas för att jämföra kategoriska variabler mellan grupper. Kvantitativa variabler kommer att presenteras som medelvärde ± standardavvikelse eller median (25:e; 75:e). Analys av kontinuerliga variabler kommer att utföras med ett t-test eller Mann Whitney-test baserat på distribution. Ett dubbelsidigt P-värde på mindre än 0,05 kommer att anses indikera statistisk signifikans i alla tester.

Utredare har redan registrerat en population på 30 friska kontroller och 25 försökspersoner som drabbats av LQTS (LQT1=9 eller LQT2=16) på sjukhuset i Nantes men med vilande QTc <480 ms. De första resultaten har identifierat en känslighet för ansträngningstest, epinefrintest och MST på 60 %, 95 % respektive 94 % inom familjerna och 76 %, 93 % och 92 % inom de positiva kontrollerna, för en specificitet på 100 % uppnådd för varje test. Detta bekräftar att MST-test kan vara av intresse hos patienter med lång QT utan tydlig QT-förlängning.

Uppgift 3: identifiera specifika gener associerade med sjukdomen

Mål: Att identifiera sällsynta varianter i nya gener som starkt bidrar till risken för VF inom stamtavlor.

Fyra stora IVF-familjer som uppvisar 6 SCD (med 2 återupplivade) och 7 oförklarade synkope-episoder som inträffade vid ung ålder har karakteriserats i Nantes. Bland dem visar 9, 10, 11 respektive 4 familjemedlemmar ett förlängt QT-intervall efter MST och/eller ett annat provokativt test medan alla LQTS-associerade gener var negativa. Beskrivningen av denna nya kliniska enhet har nyligen godkänts för publicering i Journal of the American College of Cardiology17. Förekomsten av VF/SCD- eller EKG-avvikelser hos genetiskt avlägsna individer inom familjer gör stamtavlor mycket kraftfulla för genetiska studier, eftersom ju större genetiskt avstånd, desto färre varianter kommer patienterna att dela. Observera att ytterligare släktingar kommer att undersökas kliniskt (individ med frågetecken på stamtavlor nedan) och kan öka kraften i genetikstudien. Tidigare arbeten av J. Barc och Nantes-gruppen har visat vår förmåga att leda sådana ambitiösa projekt och specifikt på genupptäckt baserat på familjärt tillvägagångssätt kopplat till nästa generations sekvensering.

uppgift 3.1: Genotypning av hela genomet och analys av de drabbade familjemedlemmarna Syfte: Identifiera en genomisk region som delas av de drabbade medlemmarna.

Genomomfattande genotypning av alla drabbade familjemedlemmar kommer att utföras med hjälp av Axiom Genome-Wide Human Precision Medicine Research Array (PMRA)-platta på Affymetrix GeneTitan® Multi-Channel, instrument tillgängligt genom den genomiska kärnanläggningen i Nantes i vårt labb. Genomiska regioner som delas av drabbade familjemedlemmar kommer att bedömas genom Identity By Descent-analys (IBD) som tidigare beskrivits. Detta steg är avgörande för att förfina genomregionen där orsaksvarianten finns. Enligt den stora storleken på familjerna kan forskarna förvänta sig att en relativt liten genomisk region kommer upp från denna analys. Uppmärksamhet kommer att ägnas åt potentiell delad region bland familjer som skulle indikera en potentiell gemensam gen.

uppgift 3.2: Helgenomsekvensering och analys Syfte: identifiera sällsynta varianter bland de genomiska regionerna som delas av drabbade familjemedlemmar.

Här ska utredarna utföra genomsekvensering i 3 avlägset besläktade individer som drabbats av CIQTP-syndrom från var och en av de 4 stamtavlorna. Fördelarna med genomsekvensering ligger i frånvaron av infångnings- och PCR-steg, vilket starkt begränsar fångstartefakterna, de icke-täckta regionerna och erbjuder möjligheten att avslöja en mutation inom ett väsentligt regulatoriskt element som hör till den icke-kodande regionen. Sekvensering kommer att utföras i samarbete med National Genotyping Center (CEA-CNG). NGS pipeline följer rekommendationerna från Broad Institute GATK "Best Practices" broadinstitute.org/gatk/guide/best-practices.php. I grund och botten mappas läsningar med hjälp av bwa-mem, dubbletter tas bort med picard, GATK används för att justera om och kalibrera läsningarna. Varianterna anropas med HaplotypeCaller och är omkalibrerade med GATK. De genererade VCF:erna kommenteras sedan med Ensembl Variant Effect-prediktor. Från VCF-filer och inom varje stamtavla ska utredarna prioritera varianter som delas av de 3 drabbade individerna och som finns inom delade genomiska regioner (IBD). Från de delade varianterna ska utredarna fokusera på sällsynta varianter och sedan filtrera bort varianter som är vanliga i den allmänna befolkningen (mindre allelfrekvens >0,1%). För detta kommer utredarna att använda offentliga och interna exom-/genomdatabaser som samlar sammanlagt cirka 130 000 exomer och 20 000 genom som The gnomAD-konsortiet, 1000Genomes, Genome of the Netherlands och demografiskt matchade kontroller specifikt från Nantes-området (PREGO-studie -www.vacarme-project.org). Detta förväntas resultera i en kortlista med få "kandidat"-varianter/gener per familj. En bioinformatisk förutsägelse av deras funktionella effekt kommer att bedömas av programmen SIFT och Polyphen2 för att lyfta fram förmodade maligna varianter bland dessa. Utredarna kommer att validera alla varianter som identifierats på sådant sätt genom Sanger-sekvensering och undersöka deras samsegregering med andra drabbade familjemedlemmar i respektive stamtavlor. Erfarenhet av kärnanläggningen för genomik och bioinformatik i Nantes i vårt labb, som är erkända som franska nationella infrastrukturer inom genomik (IBiSA) och bioinformatik (Institut Français de Bioinformatique) kopplat till vår erfarenhet av NGS-datahantering kommer att säkerställa genomförbarheten av denna uppgift. Dessutom pågår ett stort genomsekvenseringsprojekt som samlar mer än 1000 hela genom (inklusive hjärtpatienter och individer från den allmänna befolkningen) i vår grupp. Erfarenheter från detta projekt kommer att förstärka effektiviteten i analysen av uppgift nr 3 och chansen att lyckas.

Uppgift 4: utföra transkriptomisk och elektrofysiologisk profilering av inducerade pluripotenta stamcellshärledda kardiomyocyter från CIQTP-patienter för att identifiera förmodade biomarkörer och patofysiologiska mekanismer

Utredarna gör hypotesen att inducerade pluripotenta stamcellshärledda kardiomyocyter (iPSC-CM) genererade från CIQPT-patienter kommer att göra det möjligt för oss att identifiera de globala genuttrycksförändringarna och elektrofysiologiska förändringar associerade med sjukdomen. För det syftar utredarna till att jämföra iPSC-CM genererade från medlemmar av de 4 familjerna som beskrivs i uppgift 3. Inom varje stamtavla kommer utredarna att välja en "kontroll" frisk individ (som inte presenterar den familjära QT-förlängningen) och 2 CIPQT-patienter.

Positiv LQT-kontroll och negativ frisk kontroll iPS-cellinjer har redan genererats och studerats i Nantes i samband med en tidigare studie på LQT2 som visar genomförbarheten av denna uppgift. Detta kommer också att erbjuda möjlighet att jämföra CIPQT transkriptomiska och elektrofysiologiska signaturer med LTQ2. För varje linje har 3 iPS-cellkloner validerats: alla linjer har normal karyotyp och uppfyller de nuvarande standarderna för pluripotens. Utredarna differentierade framgångsrikt iPS-cellerna till hjärtlinjen, med hjälp av en nyligen beskriven metod baserad på tidsmodulering av Wnt/ß-catenin-signalering med hjälp av små molekyler. Preliminära data tyder på att utredarna kan generera hög renhet och effektivitet av hjärtdifferentiering. När det gäller iPS-cellerna från LQT2-patienten visade utredarna att hERG A561P-mutation leder till en trafikdefekt som resulterar i minskad IKr-ström, och följaktligen till aktionspotentialförlängning och cellulära arytmier (tidiga efterdepolarisationer).

Efter erhållande och validering av alla iPS-cellinjer kommer det första steget i projektet att bestå i identifieringen av den hjärtgenexpressionsprofil som är associerad med CIQTP. För det kommer utredarna att använda kardiomyocyter differentierade från kontroll- och patienthärledda iPS-celler (dag 28) för att utföra RNA-sekvensanalyser, i samarbete med Genomics kärnanläggning i vårt labb. Utredarna kommer också att utföra aktionspotential med hög genomströmning och jonströmsanalyser med hjälp av automatiserad patchclamp och optiskt baserade (CellOptiq®) tekniker under baslinjeförhållanden och efter läkemedelsinducerad adrenerg stimulering. Allt tillsammans kommer dessa analyser att ge oss den första identifieringen av den elektrofysiologiska profilen associerad med CIQTP i humana kardiomyocyter. Med denna analys kommer utredarna att kunna koppla CIQTP-associerat förändrat genuttrycksprogram till defekt hjärtfysiologi.

iPSC-hjärtdifferentieringsprotokoll: celler kommer att odlas på en Matrigel-belagd platta och exponeras för kardiogena cytokiner: CHIR och IWR-1. Slagkolonier uppstår efter cirka 10 dagar. Efter 20 dagar kommer cellerna att dissocieras och återsådda för elektrofysiologiska analyser, 10 dagar senare. Slutligen, efter 28 dagars differentiering, kommer bankande celler att samlas in för RNA-sekvensanalys.

Hela transkriptomsekvensering (RNAseq): att slå iPSC-CM efter 28 dagar med 3 differentiering från 2 kloner av varje iPS-cellinje kommer att samlas in och RNA kommer att extraheras med Macherey-Nagel-kit. Närvaro och kvantitet av varje RNA i proverna kommer sedan att bedömas med hjälp av nästa generations sekvensering (Illumina HiSeq-teknologi). Bioinformatikanalys kommer att utföras av BIRDs kärnanläggning i vårt labb.

Jonströmsinspelningar med automatiserad patchclamp: CIQTP:s repolarisationsdefekter återspeglar sannolikt dysfunktion hos specifika jonströmmar som kommer att registreras med hjälp av helcells patch-clamp: natriumström, INa, kalciumström, ICa,L och kaliumströmmar, IK och IKr.

Action potential inspelning: Denna inspelning kommer att utföras med två tekniker.

1. Isolerade slånde celler kommer att analyseras med perforerad patch-clamp-teknik med amfotericin B vid 37oC. Patchpipetter kommer att fyllas med en lösning som har en jonisk sammansättning som liknar den intracellulära vätskan.
2. Optiska inspelningar med aktionspotential kommer att utföras på kardiomyocyter efter 28 dagars differentiering, med 5 µmol/L di-8-ANEPPS som det spänningskänsliga färgämnet med hjälp av CellOptiq®-teknologin (Clyde Biosciences). Celler kommer att inkuberas vid 37°C, 5% CO2 och 20% O2 under 2 timmars inkubation av färgämnet och under inspelningen.