Prodloužení CIQTP: Role a mechanismus při náhlé srdeční smrti (IQARE-SCD)

Náhlá srdeční smrt (SCD) je hlavní příčinou úmrtí ve vyspělých zemích. Odhaduje se, že každý rok ve Francii náhle zemře 40 000 až 50 000 jedinců. Většina těchto úmrtí se týká starších lidí a souvisí s onemocněním koronárních tepen. Odhaduje se však, že každý rok ve Francii náhle zemře 4000 až 5000 jedinců ve věku od 1 do 45 let. SCD se často vyskytuje u mladých obětí bez identifikovatelných abnormalit EKG a bez strukturálních defektů. V důsledku toho zůstává většina příhod SCD u mladého dospělého nevysvětlena a je klasifikována do nepolapitelné skupiny známé jako idiopatická ventrikulární fibrilace (IVF).

Výzkumník nedávno identifikoval novou arytmickou entitu (katecholaminem indukované prodloužení QT intervalu; CIQTP) zodpovědnou za SCD a charakterizovanou normálním trváním QT v klidu, ale velkým prodloužením QT během mentálního zátěžového testu. Cílem tohoto translačního projektu je zjistit prevalenci tohoto nového fenotypu vzácného onemocnění u nevysvětleného SCD a identifikovat jeho základní patofyziologický mechanismus.

Použití mentálního zátěžového testu by mohlo být rozšířeno na další dědičné arytmické onemocnění, jako je syndrom dlouhého QT. Vzhledem k možnosti identifikace nových postižených příbuzných může vést k významnému snížení rizika recidivy náhlé srdeční smrti v rodině.

Hlavním úkolem tohoto projektu je popsat klinickou implikaci a patofyziologický mechanismus tohoto nového syndromu vedoucího k SCD.

Na základě našeho nedávného popisu tohoto katecholaminem indukovaného prodloužení QT intervalu vědci předpokládají, že:

• Tento syndrom se částečně podílí na 60 % nediagnostikovaných familiárních IVF po kompletním familiárním screeningu7. Vzhledem k tomu, že základní EKG je bez MST normální, může být identifikace takových klinických příznaků provedena testem psychické zátěže u probanda a příbuzných, kteří byli dříve považováni za neovlivněné dědičným arytmickým onemocněním.
• Mentální zátěžový test pomůže identifikovat hraniční případy jiné dědičné arytmie, jako je syndrom dlouhého QT. Tato dědičná arytmie je skutečně charakterizována geneticky podmíněným prodloužením QT intervalu pozorovaným na výchozím EKG, avšak více než třetina pacientů má na počátku pouze mírné prodloužení QT. V důsledku toho vyžadují použití provokačních testů (např. zátěžový test a adrenalinový test) k demaskování patologického prodloužení QT18. Zkoušející předpokládá, že MST může pomoci odhalit toto prodloužení QT.
• Na základě nedávno popsaného vyšetřovatele režimu autozomální dědičnosti pro toto onemocnění výzkumník předpokládá, že tento syndrom patří mezi mendelovské poruchy. Vyšetřovatelé proto navrhují použít k identifikaci hlavních genů spojených se syndromem CIQTP familiární přístup.

Cílem tohoto projektu je popsat klinickou implikaci a patofyziologický mechanismus tohoto nového syndromu vedoucího k náhlé srdeční smrti. Konkrétně se vyšetřovatelé snaží:

• určit prevalenci CIQTP u nevysvětlených SCD a identifikovat nové velké postižené rodiny
• identifikovat roli psychického stresu v prodloužení QT intervalu
• identifikovat geny spojené s onemocněním kombinací sekvenování celého genomu a analýzy Identity By Descent ve velkých rodinách
• provádět transkriptomické a elektrofyziologické profilování indukovaných kardiomyocytů odvozených z pluripotentních kmenových buněk (iPSC-CM) od pacientů s CIQTP k identifikaci domnělých biomarkerů a patofyziologických mechanismů.

Na základě tohoto translačního přístupu se výzkumníci zaměřují na popis patofyziologie a klinické implikace CIQTP u náhlé srdeční smrti. Popis tohoto nového syndromu pomocí inovativního přístupu, jako je sekvenování celého genomu a profilování iPSC-CM, může poskytnout komplexní a významný pokrok v oblasti nevysvětlených SCD. Kromě identifikace a péče o nově postižené příbuzné může pomoci definovat terapii založenou na genetické/patofyziologii.

Vyšetřovatelé již prokázali, že MST je vysoce účinný diagnostický nástroj k detekci tohoto nového syndromu, a vědci se domnívají, že může také pomoci odhalit prodloužení QT u tichých nositelů mutace LQTS. MST má tu výhodu, že se rychle a jednoduše aplikuje. Mohlo by tedy být velmi zajímavé odhalit familiární segregaci pro nevysvětlitelné srdeční elektrické defekty vykazující autozomálně dominantní přenos. Mohlo by to dodatečně snížit zjevnou nepenetraci, se kterou se setkáváme u LQTS.

Úkoly projektu

Úkol 1: určit prevalenci CIQTP u nevysvětleného SCD a identifikovat nové postižené rodiny

Většina případů SCD před 45. rokem zůstává nevysvětlena a pravděpodobně je způsobena dědičným arytmickým onemocněním6. Po nevysvětleném SCD budou do studie zahrnuty všechny po sobě jdoucí rodiny uvedené v Nantes, Rennes, Tours nebo univerzitních nemocnicích v Brestu.

Všechna dostupná data klinických probandů budou shromážděna od doporučujících lékařů a příbuzných. Při pitvě budou ze studie vyloučeni probandi, jejichž diagnóza bude dosažitelná.

Familiární screening Po nevysvětlitelném SCD před 45. rokem věku bude u prvostupňových příbuzných proveden familiární screening a poté rozšířen na další příbuzné, pokud je pozitivní. Když nebudou k dispozici příbuzní prvního stupně pro screening, provede se u vzdálenějších příbuzných.

Klinický screening bude zahrnovat přehled anamnézy, klinické vyšetření a základní EKG. Při absenci diagnózy po této první sadě vyšetření, zátěžového testu, transtorakálního echokardiogramu (TTE), provokační dávky blokátoru sodíkových kanálů (SCBC) buď ajmalinem (1 mg/kg) nebo flekainidem (2 mg/kg) a epinefrinovým testem23, 24 se uskuteční. Dodatečně bude proveden mentální zátěžový test, aby se odkrylo prodloužení QT intervalu s normálním výchozím EKG 25.

Protokol o mentálním zátěžovém testu (příloha 2) MST bude prováděn následovně. Pacienti budou umístěni do polohy na zádech bez vysvětlení průběhu testu. EKG bude zaznamenáváno na začátku a trvale během testu. MST pak bude prováděna nárazově podle úrovně vzdělání pacienta (mentální aritmetika, zeměpis nebo jména Disney postaviček pro děti) s požadavkem na správné a rychlé odpovědi. MST bude považováno za relevantní, pokud dojde ke zvýšení srdeční frekvence alespoň o 20 tepů za minutu. V případě absence zvýšení srdeční frekvence o 20 tepů za minutu bude test považován za neinterpretovatelný, pokud nebude identifikováno významné prodloužení QTc. MST obvykle trvá méně než 2 minuty. Nové EKG bude zaznamenáno 30 minut po skončení testu ve snaze získat záznam EKG s nejnižší tepovou frekvencí.

Diagnóza

EKG provedené na začátku, během zátěžového testu a během farmakologického testu budou přezkoumány dvěma lékaři zaslepenými klinickým a genetickým stavem. Všechna data budou shromažďována v základní databázi.

Diagnostická kritéria se držela doporučení z poslední konsensuální konference24,26. Vyšetřovatelé navíc zváží delta QTm > 30 ms během epinefrinového nebo psychického zátěžového testu a delta QTc > 30 ms 3 minuty po zátěžovém testu jako dostatečné pro diagnózu LQTS 27,28.

Mezi každým testem bude dodržen minimální interval 30 minut, aby se umožnila clearance katecholaminů. Všechny testy budou provedeny nejméně 5 dní po přerušení každé léčby, která by mohla narušit testy.

Tato studie je prováděna podle evropských směrnic pro klinický a genetický výzkum. Schválení protokolu bude získáno od institucionálních etických komisí. Informovaný písemný souhlas bude získán od každého pacienta, který souhlasil s účastí na klinické a genetické studii.

Statistická analýza Statistické analýzy budou provedeny pomocí softwaru Social Science® (IBM Corp., Armonk, New York). Kategoriální proměnné budou prezentovány s jejich počty a procenty. K porovnání kategoriálních proměnných mezi skupinami bude použit chí-kvadrát nebo Fisherův exaktní test (na základě očekávané frekvence).

Kvantitativní proměnné budou prezentovány jako průměr ± standardní odchylka nebo medián (25.; 75.). Analýza spojitých proměnných bude provedena pomocí t-testu nebo Mann Whitneyho testu založeného na distribuci. Srovnání mezi rodinami bude provedeno pomocí intra-familiární střední hodnoty nebo mediánu spojité proměnné, aby se omezilo zkreslení vůči velikosti rodiny. Dvoustranná P-hodnota menší než 0,05 bude považována za statistickou významnost ve všech testech.

Úkol 2: Identifikujte roli psychického stresu v prodloužení QT intervalu

Aby bylo možné identifikovat roli duševního stresu v prodloužení QT intervalu, vyšetřovatelé navíc zapíší pozitivní a negativní kontrolní skupiny v Nantes, Rennes, Tours nebo univerzitních nemocnicích Brest.

To bude spočívat v zařazení po sobě jdoucích příbuzných rodin postižených syndromem dlouhého QT intervalu bez prodloužení QT na počátku. Výsledek tohoto testu bude porovnán s konvenčním screeningem pomocí zátěžového testu a epinefrinového testu. Vyšetřovatelé se proto zaměřují na zařazení pacienta dále definovaného jako přenašeče hlavních geneticky podmíněných forem syndromu dlouhého QT (LQT1, LQT2 a LQT3, pozitivní kontrolní skupina).

Vyšetřovatelé navíc zahrnou negativní kontrolní skupinu zdravých pacientů s normálním výchozím EKG, bez srdečních strukturálních abnormalit a bez jakékoli medikace, která by mohla interferovat s MST. Tato populace se bude skládat z příbuzných rodin negativních na nevysvětlitelný screening SCD.

Diagnostická kritéria a testovací protokol budou totožné s těmi, které jsou definovány v úloze 1.

Pro každé měření budou použity tři po sobě jdoucí údery a bude vzata v úvahu průměrná hodnota získaná dvěma vyšetřovateli. QT interval bude měřen v DII nebo V5, od začátku QRS komplexu do konce T-vlny (definované jako průsečík tečny T-vlny a izoelektrické čáry). U-vlna bude z měření QT intervalu vyloučena.

Tato studie je prováděna podle evropských směrnic pro klinický a genetický výzkum. Schválení protokolu bude získáno od institucionálních etických komisí. Informovaný písemný souhlas bude získán od každého pacienta, který souhlasil s účastí v klinické a genetické studii.

Statistické analýzy budou provedeny pomocí softwaru Social Science® (IBM Corp., Armonk, New York). Srovnání mezi skupinami bude provedeno pro každý klinický a EKG parametr na začátku a během obou testů (test psychické zátěže, zátěžový test, epinefrinový test). Kategoriální proměnné budou prezentovány s jejich počty a procenty. K porovnání kategoriálních proměnných mezi skupinami bude použit chí-kvadrát nebo Fisherův exaktní test (na základě očekávané frekvence). Kvantitativní proměnné budou prezentovány jako průměr ± standardní odchylka nebo medián (25.; 75.). Analýza spojitých proměnných bude provedena pomocí t-testu nebo Mann Whitneyho testu založeného na distribuci. Dvoustranná P-hodnota menší než 0,05 bude považována za statistickou významnost ve všech testech.

Zkoušející již zapsali do nemocnice v Nantes populaci 30 zdravých kontrol a 25 subjektů postižených LQTS (LQT1=9 nebo LQT2=16), ale s klidovým QTc <480 ms. První výsledky identifikovaly senzitivitu zátěžového testu, epinefrinového testu a MST v tomto pořadí 60 %, 95 % a 94 % v rámci rodin a 76 %, 93 % a 92 % v rámci pozitivních kontrol, pro specificitu 100 % dosaženou pro každý test. To potvrzuje, že test MST může být zajímavý u pacientů s dlouhým QT intervalem s nepřítomností jasného prodloužení QT.

Úkol 3: identifikovat specifické geny spojené s onemocněním

Cíl: Identifikovat vzácné varianty v nových genech, které výrazně přispívají k riziku VF v rodokmenech.

V Nantes byly charakterizovány čtyři velké rodiny IVF s 6 SCD (se 2 resuscitovanými) a 7 nevysvětlenými epizodami synkopy vyskytujících se v mladém věku. Mezi nimi 9, 10, 11 a 4 členové rodiny vykazují prodloužený QT interval po MST a/nebo jiném provokativním testu, zatímco všechny geny spojené s LQTS byly negativní. Popis této nové klinické entity byl nedávno přijat k publikaci v Journal of the American College of Cardiology17. Výskyt abnormalit VF/SCD nebo EKG u geneticky vzdálených jedinců v rodinách činí rodokmeny vysoce účinnými pro genetické studie, protože čím větší je genetická vzdálenost, tím méně variant budou pacienti sdílet. Je třeba poznamenat, že další příbuzní budou klinicky vyšetřeni (jedinci se symboly otazníků na rodokmenech níže) a mohou zvýšit sílu genetické studie. Předchozí práce skupiny J. Barc a Nantes demonstrovaly naši schopnost vést takové ambiciózní projekty a konkrétně objevování genů založené na familiárním přístupu spojeném se sekvenováním nové generace.

úkol 3.1: Genotypizace celého genomu a analýza postižených členů rodiny Cíl: Identifikovat genomickou oblast sdílenou postiženými členy.

Genotypizace celého genomu u všech postižených členů rodiny bude provedena pomocí destičky Axiom Genome-Wide Human Precision Medicine Research Array (PMRA) na Affymetrix GeneTitan® Multi-Channel, nástroji dostupném prostřednictvím genomického základního zařízení naší laboratoře v Nantes. Genomické oblasti sdílené postiženými členy rodiny budou posouzeny analýzou Identity By Descent (IBD), jak bylo popsáno dříve. Tento krok je zásadní pro upřesnění oblasti genomu, kde se nachází kauzální varianta. Vzhledem k velké velikosti rodin mohou vyšetřovatelé očekávat, že z této analýzy vzejde relativně malá genomická oblast. Pozornost bude věnována potenciální sdílené oblasti mezi rodinami, která by indikovala potenciální společný gen.

úkol 3.2: Sekvenování a analýza celého genomu Cíl: identifikovat vzácné varianty mezi genomovými oblastmi sdílenými postiženými členy rodiny.

Zde výzkumníci provedou sekvenování genomu u 3 vzdáleně příbuzných jedinců postižených syndromem CIQTP z každého ze 4 rodokmenů. Výhody sekvenování genomu spočívají v absenci kroků zachycení a PCR, což silně omezuje artefakty zachycení, nepokryté oblasti a nabízí možnost odhalit mutaci v základním regulačním prvku patřícím do nekódující oblasti. Sekvenování bude provedeno ve spolupráci s Národním genotypizačním centrem (CEA-CNG). Plynovod NGS se řídí doporučeními Broad Institute GATK „Best Practices“ broadinstitute.org/gatk/guide/best-practices.php. V zásadě jsou čtení mapována pomocí bwa-mem, duplikáty jsou odstraněny pomocí picard, GATK se používá k opětovnému zarovnání a rekalibraci čtení. Varianty jsou volány pomocí HaplotypeCaller a jsou rekalibrovány pomocí GATK. Vygenerované hodnoty VCF jsou poté anotovány prediktorem Ensembl Variant Effect. Ze souborů VCF a v rámci každého rodokmenu budou vyšetřovatelé upřednostňovat varianty sdílené 3 postiženými jedinci a obsažené ve sdílených genomických oblastech (IBD). Ze sdílených variant se výzkumníci zaměří na vzácné varianty a poté odfiltrují varianty, které jsou běžné v obecné populaci (frekvence vedlejších alel >0,1 %). Za tímto účelem budou vyšetřovatelé používat veřejné a interní databáze exomů/genomů, které shromáždí celkem asi 130 000 exomů a 20 000 genomů, jako je konsorcium GnomAD, 1000Gomes, Genome of the Netherlands a demografické kontroly konkrétně z oblasti Nantes (studie PREGO -www.vacarme-project.org). Očekává se, že výsledkem bude krátký seznam několika „kandidátských“ variant/genů na rodinu. Bioinformatická predikce jejich funkčního účinku bude posouzena programy SIFT a Polyphen2, aby mezi nimi byly zvýrazněny domnělé maligní varianty. Vyšetřovatelé ověří všechny varianty identifikované tímto způsobem Sangerovým sekvenováním a prozkoumají jejich společnou segregaci s ostatními postiženými členy rodiny v příslušných rodokmenech. Zkušenosti se základním zařízením genomiky a bioinformatiky v Nantes naší laboratoře, které jsou uznávány jako francouzské národní infrastruktury v genomice (IBiSA) a bioinformatiky (Institut Français de Bioinformatique), spolu s našimi zkušenostmi se správou dat NGS zajistí proveditelnost tohoto úkolu. Dále v naší skupině probíhá velký projekt sekvenování genomu, který shromažďuje více než 1000 celých genomů (včetně kardiaků a jedinců z obecné populace). Zkušenosti z tohoto projektu posílí efektivitu analýzy úkolu č. 3 a šanci na úspěch.

Úkol 4: Proveďte transkriptomické a elektrofyziologické profilování indukovaných pluripotentních kardiomyocytů odvozených z kmenových buněk od pacientů s CIQTP za účelem identifikace domnělých biomarkerů a patofyziologických mechanismů

Vyšetřovatelé vycházejí z hypotézy, že indukované kardiomyocyty odvozené z pluripotentních kmenových buněk (iPSC-CM) generované od pacientů s CIQPT nám umožní identifikovat globální změny genové exprese a elektrofyziologické změny spojené s onemocněním. Za tímto účelem se výzkumníci zaměřují na porovnání iPSC-CM generovaných od členů 4 rodin popsaných v úloze 3. V rámci každého rodokmenu vyberou výzkumníci jednoho „kontrolního“ zdravého subjektu (neprezentujícího familiární prodloužení QT) a 2 pacienty s CIPQT.

Pozitivní kontrola LQT a negativní zdravá kontrola iPS buněčné linie již byly vytvořeny a studovány v Nantes v kontextu předchozí studie o LQT2, která prokázala proveditelnost tohoto úkolu. To také nabídne možnost porovnat CIPQT transkriptomický a elektrofyziologický podpis s LTQ2. Pro každou linii byly validovány 3 iPS buněčné klony: všechny linie mají normální karyotyp a splňují současné standardy pro pluripotenci. Výzkumníci úspěšně diferencovali iPS buňky do srdeční linie pomocí nedávno popsané metody založené na časové modulaci Wnt/ß-catenin signalizace pomocí malých molekul. Předběžná data naznačují, že výzkumníci mohou vytvořit vysokou čistotu a účinnost srdeční diferenciace. Pokud jde o buňky iPS od pacienta LQT2, výzkumníci ukázali, že mutace hERG A561P vede k defektu přenosu, který má za následek snížení proudu IKr, a následně e k prodloužení akčního potenciálu a buněčným arytmiím (časné po depolarizaci).

Po získání a validaci všech iPS buněčných linií bude prvním krokem projektu identifikace profilu srdeční genové exprese spojeného s CIQTP. Za tímto účelem vědci použijí kardiomyocyty diferencované z kontrolních buněk a buněk iPS odvozených od pacienta (28. den) k provedení sekvenční analýzy RNA ve spolupráci se základním zařízením Genomics naší laboratoře. Vyšetřovatelé budou také provádět vysoce výkonné analýzy akčního potenciálu a iontových proudů pomocí automatizované náplasti a optických technik (CellOptiq®) za základních podmínek a po adrenergní stimulaci vyvolané léčivem. Všechny dohromady nám tyto analýzy poskytnou první identifikaci elektrofyziologického profilu spojeného s CIQTP v lidských kardiomyocytech. Pomocí této analýzy budou vědci schopni propojit program exprese změněných genů spojený s CIQTP s defektní srdeční fyziologií.

Protokoly srdeční diferenciace iPSC: buňky budou kultivovány na destičce potažené Matrigelem a vystaveny kardiogenním cytokinům: CHIR a IWR-1. Po asi 10 dnech se objevují bitevní kolonie. Po 20 dnech budou buňky disociovány a znovu nasazeny pro elektrofyziologické analýzy, o 10 dní později. Nakonec, po 28 dnech diferenciace, budou bití buňky shromážděny pro analýzu RNA seq.

Sekvenování celého transkriptomu (RNAseq): shromáždí se bití iPSC-CM po 28 dnech 3 diferenciace ze 2 klonů každé buněčné linie iPS a RNA se extrahuje pomocí soupravy Macherey-Nagel. Přítomnost a množství každé RNA vzorků pak bude hodnoceno pomocí sekvenování nové generace (technologie Illumina HiSeq). Bioinformatickou analýzu provede základní zařízení BIRD naší laboratoře.

Záznamy iontových proudů pomocí automatizované náplasti: Repolarizační defekty CIQTP pravděpodobně odrážejí dysfunkci specifických iontových proudů, které budou zaznamenány pomocí celobuněčné náplasti: sodíkový proud, INa, vápníkový proud, ICa,L a draslíkové proudy, IKs a IKr.

Záznam akčního potenciálu: Tento záznam bude proveden pomocí 2 technik.

1. Izolované bijící buňky budou analyzovány technikou perforované patch-clamp s amfotericinem B při 37oC. Náplastové pipety budou naplněny roztokem, který má iontové složení podobné intracelulární tekutině.
2. Optické záznamy akčního potenciálu budou provedeny na kardiomyocytech po 28 dnech diferenciace, s 5 µmol/l di-8-ANEPPS jako napěťově citlivým barvivem pomocí technologie CellOptiq® (Clyde Biosciences). Buňky budou inkubovány při 37 °C, 5 % CO2 a 20 % O2 během 2 h inkubace barviva a během záznamu.