CIQTP-forlengelse: Rolle og mekanisme ved plutselig hjertedød (IQARE-SCD)

Plutselig hjertedød (SCD) er en viktig dødsårsak i utviklede land. Anslagsvis 40 000 til 50 000 individer dør plutselig hvert år i Frankrike. De fleste av disse dødsfallene involverer eldre mennesker og er relatert til koronarsykdom. Imidlertid dør anslagsvis 4000 til 5000 individer mellom 1 og 45 år plutselig hvert år i Frankrike. SCD forekommer ofte hos unge ofre uten identifiserbare EKG-avvik og uten strukturelle defekter. Som en konsekvens forblir de fleste SCD-hendelser hos den unge voksne uforklarlige og klassifiseres i en unnvikende gruppe kjent som idiopatisk ventrikkelflimmer (IVF).

Etterforsker identifiserte nylig en ny arytmisk enhet (katekolamin-indusert QT-forlengelse; CIQTP) som er ansvarlig for SCD og karakterisert ved normal QT-varighet i hvile, men betydelig QT-forlengelse under mental stresstest. Målet med dette translasjonsprosjektet er å bestemme utbredelsen av denne nye fenotypen av sjelden sykdom ved uforklarlig SCD og identifisere dens underliggende patofysiologiske mekanisme.

Bruken av mental stresstest kan utvides til andre arvelige arytmiske sykdommer som lang QT-syndrom. Gitt potensialet for identifikasjon av nye berørte slektninger kan det føre til en betydelig reduksjon av risikoen for plutselig tilbakefall av hjertedød i en familie.

Hovedproblemet i dette prosjektet er å beskrive den kliniske implikasjonen og den patofysiologiske mekanismen til dette nye syndromet som fører til SCD.

Basert på vår nylige beskrivelse av denne katekolamininduserte QT-forlengelsen, antar etterforskerne at:

• Dette syndromet er delvis involvert i 60 % av udiagnostisert familiær IVF etter fullstendig familiær screening7. Faktisk, siden baseline-EKG er normalt uten MST, kan identifisering av slike kliniske trekk utføres ved mental stresstest hos proband og slektninger som tidligere ble ansett som upåvirket av arvelig arytmisk sykdom.
• Mental stresstest vil bidra til å identifisere grensetilfeller av andre arvelige arytmier som for eksempel lang QT-syndrom. Faktisk er denne arvelige arytmien karakterisert ved en genetisk basert forlengelse av QT-intervallet observert på baseline-EKG, men mer enn en tredjedel av pasientene har kun en liten QT-forlengelse ved baseline. Følgelig krever de bruk av provokasjonstester (f.eks. treningstest og adrenalintest) for å avsløre patologisk QT-forlengelse18. Etterforskeren antar at MST kan bidra til å avsløre denne QT-forlengelsen.
• Basert på etterforskeren av autosomal arvemodus som nylig er beskrevet for denne sykdommen, antar etterforskeren at dette syndromet tilhører de mendelske lidelsene. Derfor foreslår etterforskerne å bruke en familiær tilnærming for å identifisere de viktigste genene assosiert med CIQTP-syndromet.

Omfanget av dette prosjektet er å beskrive den kliniske implikasjonen og den patofysiologiske mekanismen til dette nye syndromet som fører til plutselig hjertedød. Mer spesifikt har etterforskerne som mål å:

• bestemme prevalensen av CIQTP i uforklarlig SCD og identifisere nye store berørte familier
• identifisere rollen til psykisk stress i QT-forlengelse
• identifisere assosierte gener med sykdommen ved å kombinere helgenomsekvensering og Identity By Descent-analyse i store familier
• utføre transkriptomisk og elektrofysiologisk profilering av induserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter (iPSC-CM) fra CIQTP-pasienter for å identifisere antatte biomarkører og patofysiologiske mekanismer.

Basert på denne translasjonstilnærmingen tar etterforskerne sikte på å beskrive patofysiologi og klinisk implikasjon av CIQTP ved plutselig hjertedød. Beskrivelsen av dette nye syndromet ved bruk av innovativ tilnærming som helgenomsekvensering og iPSC-CM-profilering kan gi en omfattende og stor fremgang innen uforklarlig SCD. Utover identifikasjon og omsorg for nylig berørte slektninger, kan det hjelpe å definere en genetisk/patofysiologisk basert terapi.

Etterforskerne har allerede bevist at MST er et svært effektivt diagnostisk verktøy for å oppdage dette nye syndromet, og etterforskerne mener at det også kan bidra til å avsløre QT-forlengelse hos tause LQTS-mutasjonsbærere. MST har fordelen av å være rask og enkel å bruke. Det kan derfor være av stor interesse å avdekke familiær segregering for uforklarlige elektriske hjertefeil som viser autosomal dominant overføring. Det kan i tillegg redusere den tilsynelatende ikke-penetransen som oppstår i LQTS.

Prosjektets oppgaver

Oppgave 1: Bestem prevalensen av CIQTP i uforklarlig SCD og identifiser nye berørte familier

De fleste tilfeller av SCD før fylte 45 forblir uforklarlige og skyldes sannsynligvis arvelig arytmisk sykdom6. Etter uforklarlig SCD vil alle påfølgende familier henvist til Nantes, Rennes, Tours eller Brest universitetssykehus inkluderes i studien.

Alle tilgjengelige kliniske probanddata vil bli samlet inn fra henvisende leger og pårørende. Når obduksjon utføres, vil probandene hvis diagnose vil være oppnåelig, bli ekskludert fra studien.

Familiær screening Etter uforklarlig SCD før fylte 45 år vil familiær screening utføres i førstegrads slektninger og deretter utvides til andre slektninger dersom positiv. Når førstegradsslektninger ikke er tilgjengelige for screening, vil det bli utført i fjernere slektninger.

Klinisk screening vil inkludere en gjennomgang av tidligere sykehistorie, klinisk undersøkelse og baseline EKG. I fravær av diagnose etter dette første settet med undersøkelser, stresstest, transthorax ekkokardiogram (TTE), natriumkanalblokkerutfordring (SCBC) enten med ajmalin (1 mg/kg) eller flekainid (2 mg/kg) og en epinefrintest23, 24 vil bli utført. Mental stresstest vil i tillegg bli utført for å avsløre QT-forlengelse med normal baseline EKG 25.

Protokoll for mental stresstest (vedlegg 2) MST vil bli utført som følger. Pasienter vil bli plassert i ryggleie uten noen forklaring på testforløpet. EKG vil bli registrert ved baseline og permanent under testen. MST vil da bli utført brått i henhold til pasientens utdanningsnivå (hoderegning, geografi eller navn på Disney-karakterer for barn) med krav om korrekte og raske svar. MST vil bli vurdert som relevant ved en økning på minst 20 slag per minutt i hjertefrekvensen. Ved fravær av en økning på 20 slag per minutt i hjertefrekvensen, vil testen anses som ikke-tolkbar med mindre en betydelig forlengelse av QTc er identifisert. MST varer vanligvis mindre enn 2 minutter. Et nytt EKG vil bli registrert 30 minutter etter slutten av testen i et forsøk på å få et EKG-spor med lavest hjertefrekvens.

Diagnose

EKG utført ved baseline, under stresstesten og under den farmakologiske testen vil bli gjennomgått av to leger som er blindet for den kliniske og genetiske statusen. Alle data vil bli samlet i en kjernedatabase.

Diagnosekriteriene fulgte retningslinjene fra den siste konsensuskonferansen24,26. Etterforskerne vil i tillegg vurdere delta QTm > 30 ms under adrenalin eller mental stresstest og delta QTc > 30 ms 3 minutter etter stresstesten, som tilstrekkelig for diagnose av LQTS 27,28.

Et minimumsintervall på 30 minutter mellom hver test vil bli observert for å muliggjøre katekolaminclearance. Alle tester vil bli utført minst 5 dager etter avbrudd av hver behandling som kan forstyrre testene.

Denne studien er utført i henhold til europeiske retningslinjer for klinisk og genetisk forskning. Protokollgodkjenning vil bli innhentet fra institusjonelle etiske komiteer. Informert skriftlig samtykke vil bli innhentet fra hver pasient som godtok å delta i den kliniske og genetiske studien.

Statistisk analyse Statistiske analyser vil bli utført med Social Science®-programvare (IBM Corp., Armonk, New York). Kategoriske variabler vil bli presentert med sine tall og prosenter. Chi-kvadrat- eller Fisher-eksakte testen (basert på forventet frekvens) vil bli brukt til å sammenligne kategoriske variabler mellom grupper.

Kvantitative variabler vil bli presentert som gjennomsnitt ± standardavvik eller median (25.; 75.). Analyse av kontinuerlige variabler vil bli utført ved hjelp av en t-test eller Mann Whitney-test basert på distribusjon. Sammenligninger mellom familier vil bli utført ved å bruke intra-familiær middelverdi eller median av kontinuerlig variabel for å begrense skjevheten mot familiestørrelse. En tosidig P-verdi på mindre enn 0,05 vil bli vurdert for å indikere statistisk signifikans i alle tester.

Oppgave 2: identifisere rollen til psykisk stress i QT-forlengelse

For å identifisere rollen til mental stress i QT-forlengelse vil etterforskerne i tillegg registrere positive og negative kontrollgrupper i Nantes, Rennes, Tours eller Brest universitetssykehus.

Dette vil bestå i registrering av påfølgende slektninger til familier som er rammet av langt QT-syndrom uten QT-forlengelse ved baseline. Resultatet av denne testen vil bli sammenlignet med konvensjonell screening ved bruk av treningstest og epinefrintest. Derved tar etterforskerne sikte på å registrere pasienter videre definert som bærere av de viktigste genetisk-baserte formene for langt QT-syndrom (LQT1, LQT2 og LQT3, positiv kontrollgruppe).

Etterforskerne vil i tillegg inkludere en negativ kontrollgruppe av friske pasienter med normal baseline EKG, ingen strukturelle hjerteavvik og uten medisiner som kan forstyrre MST. Denne populasjonen vil bestå av slektninger til familier som er negative for uforklarlig SCD-screening.

Diagnosekriterier og testprotokoll vil være identiske med de som er definert i oppgave 1.

Tre påfølgende slag vil bli brukt for hver måling, og gjennomsnittsverdien oppnådd av de to etterforskerne vil bli tatt i betraktning. QT-intervall vil bli målt i DII eller V5, fra begynnelsen av QRS-komplekset til slutten av T-bølgen (definert som skjæringspunktet mellom tangenten til T-bølgen og den isoelektriske linjen). U-bølge vil bli ekskludert fra målingen av QT-intervallet.

Denne studien er utført i henhold til europeiske retningslinjer for klinisk og genetisk forskning. Protokollgodkjenning vil bli innhentet fra institusjonelle etiske komiteer. Informert skriftlig samtykke vil bli innhentet fra hver pasient som godtok å delta i den kliniske og genetiske studien.

Statistiske analyser vil bli utført med Social Science®-programvare (IBM Corp., Armonk, New York). Sammenligninger mellom grupper vil bli utført for hver klinisk og EKG-parameter ved baseline og under begge testene (mental stresstest, treningstest, epinefrintest). Kategoriske variabler vil bli presentert med sine tall og prosenter. Chi-kvadrat- eller Fisher-eksakte testen (basert på forventet frekvens) vil bli brukt til å sammenligne kategoriske variabler mellom grupper. Kvantitative variabler vil bli presentert som gjennomsnitt ± standardavvik eller median (25.; 75.). Analyse av kontinuerlige variabler vil bli utført ved hjelp av en t-test eller Mann Whitney-test basert på distribusjon. En tosidig P-verdi på mindre enn 0,05 vil bli vurdert for å indikere statistisk signifikans i alle tester.

Etterforsker har allerede registrert en populasjon på 30 friske kontroller og 25 forsøkspersoner på Nantes sykehus med LQTS (LQT1=9 eller LQT2=16), men med hvile QTc <480 ms. De første resultatene har identifisert en sensitivitet for treningstest, epinefrintest og MST på henholdsvis 60 %, 95 % og 94 % i familiene, og 76 %, 93 % og 92 % i de positive kontrollene, for en spesifisitet på 100 % nådd for hver test. Dette bekrefter at MST-test kan være av interesse hos pasienter med lang QT uten tydelig QT-forlengelse.

Oppgave 3: identifisere spesifikke gener knyttet til sykdommen

Mål: Å identifisere sjeldne varianter i nye gener som bidrar sterkt til risikoen for VF innenfor stamtavler.

Fire store IVF-familier med 6 SCD (med 2 gjenopplivede) og 7 uforklarlige synkope-episoder som oppstår i ung alder, er blitt karakterisert i Nantes. Blant dem viser henholdsvis 9, 10, 11 og 4 familiemedlemmer et forlenget QT-intervall etter MST og/eller en annen provoserende test mens alle LQTS-assosierte gener var negative. Beskrivelsen av denne nye kliniske enheten har nylig blitt akseptert for publisering i Journal of the American College of Cardiology17. Forekomsten av VF/SCD- eller EKG-avvik hos genetisk fjerne individer innen familier gjør stamtavler svært kraftige for genetiske studier, siden jo større genetisk avstand, jo færre varianter vil pasientene dele. Bemerkelsesverdig vil flere slektninger bli undersøkt klinisk (individ med spørsmålstegn symboler på stamtavler nedenfor) og kan øke kraften til genetikkstudien. Tidligere arbeider av J. Barc og Nantes-gruppen demonstrerte vår evne til å lede slike ambisiøse prosjekter og spesielt på genoppdagelse basert på familiær tilnærming koblet til neste generasjons sekvensering.

oppgave 3.1: Genotyping av hele genomet og analyse av de berørte familiemedlemmene Mål: Identifisere en genomisk region som deles av de berørte medlemmene.

Genomomfattende genotyping på alle berørte familiemedlemmer vil bli utført ved å bruke Axiom Genome-Wide Human Precision Medicine Research Array (PMRA) plate på Affymetrix GeneTitan® Multi-Channel, instrument tilgjengelig gjennom den genomiske kjernefasiliteten til Nantes i laboratoriet vårt. Genomiske regioner som deles av berørte familiemedlemmer vil bli vurdert ved Identity By Descent (IBD) analyse som tidligere beskrevet. Dette trinnet er avgjørende for å avgrense genomregionen der årsaksvarianten er lokalisert. I henhold til den store størrelsen på familiene kan etterforskerne forvente at en relativt liten genomisk region vil komme opp fra denne analysen. Oppmerksomhet vil bli dedikert til potensiell delt region blant familier som kan indikere et potensielt felles gen.

oppgave 3.2: Helgenomsekvensering og analyse Mål: identifisere sjeldne varianter blant de genomiske regionene som deles av berørte familiemedlemmer.

Her skal etterforskerne utføre genomsekvensering i 3 fjernt beslektede individer rammet av CIQTP syndrom fra hver av de 4 stamtavlene. Fordelene med genomsekvensering ligger i fraværet av fangst- og PCR-trinn, og begrenser sterkt fangstartefaktene, de ikke-dekkede regionene og gir muligheten for å avdekke en mutasjon innenfor et essensielt regulatorisk element som tilhører den ikke-kodende regionen. Sekvensering vil bli utført i samarbeid med National Genotyping Center (CEA-CNG). NGS-rørledningen følger anbefalingene fra Broad Institute GATK "Best Practices" broadinstitute.org/gatk/guide/best-practices.php. I utgangspunktet kartlegges lesninger ved hjelp av bwa-mem, duplikater fjernes ved hjelp av picard, GATK brukes til å justere og rekalibrere avlesningene. Variantene kalles med HaplotypeCaller og er rekalibrert med GATK. De genererte VCF-ene blir deretter kommentert med Ensembl Variant Effect-prediktor. Fra VCF-filer og innenfor hver stamtavle, skal etterforskerne prioritere varianter som deles av de 3 berørte individene og inneholdt i delte genomiske regioner (IBD). Fra de delte variantene skal etterforskerne fokusere på sjeldne varianter og deretter filtrere ut varianter som er vanlige i den generelle befolkningen (mindre allelfrekvens >0,1 %). For dette vil etterforskerne bruke offentlige og interne eksom-/genomdatabaser som samler totalt rundt 130 000 eksomer og 20 000 genomer som The gnomAD-konsortiet, 1000Genomes, Genome of the Netherlands og demografisk matchede kontroller spesifikt fra Nantes-området (PREGO-studie -www.vacarme-project.org). Dette forventes å resultere i en kortliste med få "kandidat" varianter/gener per familie. En bioinformatikkprediksjon av deres funksjonelle effekt vil bli vurdert av programmene SIFT og Polyphen2 for å fremheve antatte maligne varianter blant disse. Etterforskerne vil validere alle varianter identifisert på en slik måte ved Sanger-sekvensering og undersøke deres samsegregering med andre berørte familiemedlemmer i de respektive stamtavlene. Erfaring fra kjerneanlegget for genomikk og bioinformatikk til Nantes i laboratoriet vårt, som er anerkjent som fransk nasjonal infrastruktur innen genomikk (IBiSA) og bioinformatikk (Institut Français de Bioinformatique) kombinert med vår erfaring med NGS-databehandling vil sikre gjennomførbarheten av denne oppgaven. Videre pågår et stort genomsekvenseringsprosjekt som samler mer enn 1000 hele genomer (inkludert hjertepasienter og individer fra den generelle befolkningen) i vår gruppe. Erfaring fra dette prosjektet vil forsterke effektiviteten av oppgave#3-analysen og sjansen for å lykkes.

Oppgave 4: utføre transkriptomisk og elektrofysiologisk profilering av induserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter fra CIQTP-pasienter for å identifisere antatte biomarkører og patofysiologiske mekanismer

Etterforskerne kommer med hypotesen om at induserte pluripotente stamcelle-avledede kardiomyocytter (iPSC-CMs) generert fra CIQPT-pasienter vil tillate oss å identifisere de globale genuttrykksendringene og elektrofysiologiske endringer assosiert med sykdommen. For det tar etterforskerne sikte på å sammenligne iPSC-CM generert fra medlemmer av de 4 familiene beskrevet i oppgave 3. Innenfor hver stamtavle vil etterforskerne velge en "kontroll" frisk person (som ikke presenterer den familiære QT-forlengelsen), og 2 CIPQT-pasienter.

Positiv LQT-kontroll og negativ sunn kontroll iPS-cellelinjer har allerede blitt generert og studert i Nantes i en sammenheng med en tidligere studie på LQT2 som demonstrerer gjennomførbarheten av denne oppgaven. Dette vil også gi muligheten til å sammenligne CIPQT transkriptomiske og elektrofysiologiske signaturer med LTQ2. For hver linje har 3 iPS-cellekloner blitt validert: alle linjer har normal karyotype og oppfyller gjeldende standarder for pluripotens. Etterforskerne differensierte med hell iPS-cellene til hjerteavstamningen, ved å bruke en nylig beskrevet metode basert på tidsmodulasjon av Wnt/ß-catenin-signalering ved bruk av små molekyler. Foreløpige data tyder på at etterforskerne kan generere høy renhet og effektivitet av hjertedifferensiering. Når det gjelder iPS-cellene fra LQT2-pasienten, viste etterforskerne at hERG A561P-mutasjon fører til en trafficking-defekt som resulterer i redusert IKr-strøm, og følgelig e til aksjonspotensialforlengelse og cellulære arytmier (tidlige etterdepolarisasjoner).

Ved oppnåelse og validering av alle iPS-cellelinjer, vil det første trinnet i prosjektet bestå i identifisering av hjertegenekspresjonsprofilen assosiert med CIQTP. For det vil etterforskerne bruke kardiomyocytter differensiert fra kontroll- og pasientavledede iPS-celler (dag 28) for å utføre RNA-seq-analyser, i samarbeid med Genomics-kjerneanlegget i laboratoriet vårt. Etterforskerne vil også utføre aksjonspotensiale med høy gjennomstrømning og ionestrømanalyser ved bruk av automatisert lappklemme og optisk baserte (CellOptiq®) teknikker under baseline forhold og etter medikamentindusert adrenerg stimulering. Alt sammen vil disse analysene gi oss den første identifiseringen av den elektrofysiologiske profilen assosiert med CIQTP i humane kardiomyocytter. Med denne analysen vil etterforskerne kunne koble CIQTP-assosiert endret genuttrykksprogram til defekt hjertefysiologi.

iPSC hjertedifferensieringsprotokoller: celler vil bli dyrket på en Matrigel-belagt plate og eksponert for kardiogene cytokiner: CHIR og IWR-1. Bankende kolonier vises etter omtrent 10 dager. Etter 20 dager vil cellene dissosieres og seedes på nytt for elektrofysiologiske analyser, 10 dager senere. Til slutt, etter 28 dager med differensiering, vil bankende celler samles inn for RNA-sekvensanalyse.

Hele transkriptomsekvensering (RNAseq): slå iPSC-CMs etter 28 dager med 3 differensiering fra 2 kloner av hver iPS-cellelinje vil bli samlet og RNA vil bli ekstrahert ved hjelp av Macherey-Nagel-settet. Tilstedeværelse og mengde av hvert RNA i prøvene vil deretter bli vurdert ved hjelp av neste generasjons sekvensering (Illumina HiSeq-teknologi). Bioinformatikkanalyse vil bli utført av BIRDs kjerneanlegg i laboratoriet vårt.

Ionestrømregistreringer med automatisert lappklemme: CIQTPs repolarisasjonsdefekter reflekterer sannsynligvis dysfunksjon av spesifikke ioniske strømmer som vil bli registrert ved bruk av helcelle lappklemme: natriumstrøm, INa, kalsiumstrøm, ICa,L og kaliumstrømmer, IK og IKr.

Aksjonspotensialopptak: Dette opptaket vil bli utført ved hjelp av 2 teknikker.

1. Isolerte bankende celler vil bli analysert ved bruk av perforert patch-clamp-teknikk med amfotericin B ved 37oC. Patch-pipetter vil bli fylt med en løsning som har en ionisk sammensetning som ligner på den intracellulære væsken.
2. Aksjonspotensiale optiske opptak vil bli utført på kardiomyocytter etter 28 dager med differensiering, med 5 µmol/L di-8-ANEPPS som det spenningsfølsomme fargestoffet ved bruk av CellOptiq®-teknologien (Clyde Biosciences). Celler vil bli inkubert ved 37 °C, 5 % CO2 og 20 % O2 under 2 timers inkubering av fargestoffet og under registreringen.