중증 천식에서 호산구의 대체 기능에 대한 생물학적 제제의 영향

중증 천식은 천식 인구의 3~5%에서 관찰되며 더 높은 악화율, 제대로 조절되지 않는 천식 및/또는 불량한 폐 기능을 특징으로 합니다. 지난 10년 동안 항-IgE 및 항-IL5(및 항-IL5R)는 중증 천식 상태를 상당히 개선했습니다. 코르티코스테로이드의 만성 또는 경구용 치료는 실제로 많은 부작용의 원인이 됩니다. 그러나 항-IL5 및 항-IgE에 대한 반응자의 예측을 위한 바이오마커가 부족합니다.

우리는 이전에 객담 호산구 수가 항-IL5를 사용하는 중증 천식 환자의 폐 기능 개선에 대한 좋은 예측 인자라는 것을 발견했습니다(Schleich et al, in press in Clin Exp Allergy 2020). 객담 세포는 메폴리주맙에 대한 반응자에 대한 유일한 관련 객담 마커가 아닐 수 있습니다.

목적은 객담 사이토카인(단백질 수준 및 유전자)(IL-3, IL-4, IL-5, IL-13, IL-33 및 GM-CSF)이 6일 이후 중증 천식 환자의 반응을 예측하는 능력을 평가하는 것입니다. 악화 및 코르티코스테로이드 사용 감소, FEV1 개선, 천식 조절, 천식 삶의 질, 가래 및 혈액 염증에 대한 영향 측면에서 생물학적 제제로 수 개월 치료.

CHU of Liege의 천식 클리닉에서 볼 수 있는 중증 천식 환자는 혈액 샘플, 유도된 가래, 폐 기능, FeNO, 천식 조절 설문지(ACT - ACQ) 및 천식 삶의 질 설문지(AQLQ)의 기준 측정을 사용하여 매우 잘 특징지어집니다.

전년도 악화 및 현재 흡입 및 경구 치료에 대한 데이터도 기록됩니다. FEV1 값이 예측값의 70%보다 높으면 중증 천식 환자도 기관지 과민성을 평가하기 위해 메타콜린 검사를 시행합니다.

이 모든 조치는 메폴리주맙으로 6개월 치료한 후 반복됩니다. 모든 객담 상등액은 -80°C에 보관되며 객담 세포의 RNA도 사용할 수 있습니다.

대상 샘플 크기: 50명의 환자

우리는 객담에서 서로 다른 사이토카인(IL3, GM-CSF, IL5, IL-13, IL-33, IL-4…)을 측정하고 서로 다른 생물학적 제제로 6개월 치료 후 반응을 예측하는 능력을 평가할 계획입니다. 악화 및 코르티코스테로이드 사용 감소, FEV1 개선(+200ml), 천식 조절(ACQ 감소 >0.5, ACT 증가 >3), 천식 삶의 질(AQLQ 점수 > 0.5 증가) 및 가래 및 혈액에 대한 영향 염증.

천식 환자는 외래 진료소 및 폐 재활 센터 (CHU, Sart-Tilman, Liege)를 통해 모집됩니다. 천식은 GINA 지침(http://ginasthma.org/)에 설명된 대로 진단됩니다.

가래 유도 및 처리. 이전에 설명한 대로 객담을 유도하고 처리합니다(Delvaux Thorax 2014). 전체 가래를 플라스틱 용기에 모아 무게를 재고 3부피의 인산완충식염수(PBS)로 균질화하고 30초 동안 vortex한 후 4°C에서 800g에서 10분 동안 원심분리합니다. 상등액을 세포에서 분리합니다. 2층의 멸균 거즈를 통해 여과하여 펠렛. 동량의 6.5mM 디티오트레이톨을 첨가하여 점액 용해를 수행하고 현탁액을 20분 동안 흔들었다. 550g에서 10분 동안 원심분리한 후, 수동 혈구계산기를 사용하여 트리판 블루 배제로 편평 세포 및 총 세포 수 및 세포 생존율을 확인합니다. 500 세포에서 May-Grunwald-Giemsa로 염색된 시토스핀에서 차등 백혈구 수를 수행합니다.

품질 기준(편평 세포의 < 30% 및 생존율 > 50%)이 준수되는 경우, 세포 펠릿을 5부피의 RNAprotect 세포 시약(Qiagen, Hilden, Germany)과 혼합하고 RNA 추출까지 -80°C에서 보관합니다.

항-IL-5, 항-IL5R 또는 항-IgE 요법 전 및 6개월 후 성공적인 유도 객담 상청액 샘플을 가진 총 50명의 환자를 분석할 것입니다. 가래 세포와 관련하여 치료 전후에 양질의 샘플을 가진 환자는 유전자 발현 분석을 할 수 있습니다.

면역검정: 객담 상청액에 함유된 매개체의 농도를 제조업체의 지침에 따라 ELISA Luminex 성능 검정(R and D systems, Minneapolis, USA)으로 평가합니다. 객담 상청액에서 사이토카인의 스파이킹 실험을 수행하여 모든 분석물의 회수율이 80%~120%인지 확인합니다.

RNA 추출 및 RT-qPCR 방법 매개체 단백질 수준은 IL-3 및 IL-4에 대해 Luminex performance XL discovery kit(R and D systems, Minneapolis, USA)를 사용하여 얻을 것입니다(검출 한계: 둘 다에 대해 0.09 pg/ml). Luminex 고감도 성능 키트는 IL-5, IL-13, IL-33 및 GM-CSF에 사용됩니다. 검출 한계는 각각 0.4, 5.1, 1.8 및 1.6 pg/ml입니다.

중재자 유전자 발현 수준과 관련하여 단계는 최근에 설명한 대로 정확하게 수행됩니다. 프라이머 및 프로브는 모두 IDT(Integrated DNA Technologies, Skokie, IL, USA)에서 얻을 수 있습니다. qbase+ qPCR 분석 소프트웨어(Biogazelle, Zwijnaarde, Belgium)를 사용하여 PCR 효율을 계산합니다. 동일한 프로그램을 사용하여 2-∆∆Ct 방법을 사용하여 유전자 발현의 상대 정량을 얻습니다. HPRT1 및 GNB2L1은 이전에 보고된 바와 같이 참조 유전자로 사용될 것입니다. 환자들은 7명의 건강한 피험자들의 코호트와 비교될 것입니다.

이러한 단계는 Taqman PCR 단계가 96-웰 플레이트에서 수행되고 각 샘플에 대해 2 μl의 cDNA(1:4 희석)가 사용된다는 점을 제외하고 da Silva 등[Clin Exp 알레르기 2017]의 설명에 따라 수행됩니다. 500 nM 정방향 프라이머, 500 nM 역방향 프라이머 및 모든 테스트된 유전자에 대한 250 nM 프로브를 포함하는 12.5 μl의 총 반응 부피에서. 모든 qPCR은 중복으로 실현되며 각 유전자에 대한 비템플릿 컨트롤이 포함됩니다. 증폭은 LightCycler 480 Real-Time PCR(Roche, Pleasanton, CA, USA)에서 다음과 같이 45주기 동안 수행됩니다. 초기 활성화 단계: 95°C에서 15분; 변성 단계: 94°C에서 15초; 어닐링 및 연신 단계: 60°C에서 1분간. 프라이머 및 프로브는 모두 리포터 및 이중 소광제 염료 5'6-카르복시플루오레세인/ZEN/3' 아이오와 블랙 FQ(5'6-FAM/ZEN/3'IBFQ)로 라벨링되었으며 IDT(Integrated DNA Technologies, Skokie)에서 입수했습니다. , 일리노이, 미국). 얻은 모든 PCR 효율이 1.9와 2.1 사이인지 확인하기 위해 스톡 cDNA의 4배 연속 희석(4개 cDNA 풀)을 사용하여 각 유전자에 대한 표준 곡선을 생성합니다. 게놈 DNA 오염은 RT 단계 없이 각 RNA 샘플로 qPCR을 수행하여 제어됩니다. 유전자 발현의 상대 정량은 2-∆∆Ct 방법을 사용하여 qbase+ qPCR 분석 소프트웨어(Biogazelle, Zwijnaarde, Belgium)를 사용하여 결정됩니다. HPRT1 및 GNB2L1은 이전에 결정된 참조 유전자로 사용됩니다. qPCR 실험에 필요한 최소한의 정보는 MIQE 가이드라인에 따라 모든 절차를 진행합니다.

사이토카인은 일부 환자의 혈액에서도 측정됩니다.

연구 종점

기본 끝점:

악화 및 경구용 코르티코스테로이드 용량 감소의 예측 인자를 확인합니다.

보조 끝점:

ACQ(-0.5)의 개선 예측 변수를 식별하기 위해, ACT(+3점), AQLQ(+0.5), 객담 호산구(<3%), FEV1(+200ml).

통계 계획 또는 데이터 분석 결과는 연속 변수에 대해 평균±SD 또는 평균±SEM으로 표현됩니다. 치우친 분포의 중앙값(범위). 범주형 변수의 경우 관측치 수와 백분율이 각 범주에 제공됩니다. 서로 다른 하위 그룹 간의 비교는 Kruskal-Wallis 테스트 또는 대응 t-테스트/Wilcoxon 부호 순위 테스트로 수행됩니다. Spearman 상관 계수는 임상 매개변수 간의 연관성을 측정하는 데 사용됩니다.

검정력 계산은 결과의 변화를 확인하기 위해 필요한 총 50명의 피험자 크기를 나타냅니다.