Wpływ leków biologicznych na alternatywne funkcje eozynofili w ciężkiej astmie

Astmę ciężką obserwuje się u 3 do 5% populacji chorych na astmę i charakteryzuje się ona większą częstością zaostrzeń, źle kontrolowaną astmą i/lub słabą czynnością płuc. W ciągu ostatnich dziesięciu lat anty-IgE i anty-IL5 (oraz anty-IL5R) znacznie poprawiły stan astmy ciężkiej. Leczenie przewlekłym lub doustnym kursem kortykosteroidów jest rzeczywiście odpowiedzialne za wiele skutków ubocznych. Brakuje jednak biomarkerów do przewidywania odpowiedzi na anty-IL5 i anty-IgE.

Wcześniej stwierdziliśmy, że liczba eozynofili w plwocinie jest dobrym predyktorem poprawy czynności płuc u chorych na ciężką astmę przy użyciu anty-IL5 (Schleich i in., w druku w Clin Exp Allergy 2020). Komórki plwociny mogą nie być jedynym istotnym markerem plwociny dla osób reagujących na mepolizumab.

Celem jest ocena zdolności cytokin plwociny (stężeń białek i genów) (IL-3, IL-4, IL-5, IL-13, IL-33 i GM-CSF) do przewidywania odpowiedzi chorych na ciężką astmę po 6 miesięcy leczenia lekami biologicznymi pod względem zmniejszenia częstości zaostrzeń i stosowania kortykosteroidów, poprawy FEV1, kontroli astmy, jakości życia z astmą oraz wpływu na zapalenie plwociny i krwi.

Osoby z ciężką astmą obserwowane w Klinice Astmy CHU w Liege są bardzo dobrze scharakteryzowane za pomocą podstawowych pomiarów próbek krwi, indukowanej plwociny, czynności płuc, FeNO, kwestionariuszy kontroli astmy (ACT - ACQ) i kwestionariuszy jakości życia w astmie (AQLQ).

Rejestrowane są również dane dotyczące zaostrzeń w ciągu poprzedniego roku oraz aktualnego leczenia wziewnego i doustnego. Jeśli wartość FEV1 przekracza 70% wartości przewidywanej, chorzy na ciężką astmę również wykonują prowokację metacholiną w celu oceny nadreaktywności oskrzeli.

Wszystkie te działania powtarza się po 6 miesiącach leczenia mepolizumabem. Wszystkie supernatanty plwociny są przechowywane w temperaturze -80°C, dostępny jest również RNA z komórek plwociny.

Docelowa wielkość próby: 50 pacjentów

Planujemy oznaczyć różne cytokiny w plwocinie (IL3, GM-CSF, IL5, IL-13, IL-33, IL-4…) i ocenić ich zdolność do przewidywania odpowiedzi po 6 miesiącach leczenia różnymi lekami biologicznymi pod względem zmniejszenie częstości zaostrzeń i stosowania kortykosteroidów, poprawa FEV1 (+200 ml), kontrola astmy (spadek ACQ >0,5, wzrost ACT >3), jakość życia w astmie (wzrost AQLQ >0,5) oraz wpływ na plwocinę i krew zapalenie.

Pacjenci z astmą są rekrutowani przez ambulatorium i centrum rehabilitacji oddechowej (CHU, Sart-Tilman, Liege). Astmę diagnozuje się zgodnie z wytycznymi GINA (http://ginasthma.org/).

Indukcja i przetwarzanie plwociny. Plwocina jest indukowana i przetwarzana w sposób opisany wcześniej (Delvaux Thorax 2014). Całą plwocinę zbiera się do plastikowego pojemnika, waży i homogenizuje z trzema objętościami soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), wiruje przez 30 s i odwirowuje przy 800 g przez 10 min w temperaturze 4°C. Supernatant oddziela się od komórki osad przez filtrację przez 2 warstwy sterylnej gazy. Mukolizę przeprowadza się przez dodanie równej objętości 6,5 mM ditiotreitolu i zawiesinę wstrząsa się przez 20 min. Po wirowaniu przez 10 minut przy 550 g komórki płaskonabłonkowe i całkowitą liczbę komórek, jak również żywotność komórek sprawdza się przez wykluczanie błękitem trypanu za pomocą ręcznego hemocytometru. Zróżnicowaną liczbę leukocytów przeprowadza się na cytospinach barwionych May-Grünwald-Giemsa na 500 komórkach.

Jeżeli spełnione są kryteria jakości (< 30% komórek płaskonabłonkowych i żywotność > 50%), osad komórkowy miesza się z 5 objętościami odczynnika RNAprotect cell reagent (Qiagen, Hilden, Niemcy) i przechowuje w temperaturze -80°C do czasu ekstrakcji RNA.

Ogółem przeanalizowanych zostanie 50 pacjentów, u których pomyślnie wywołano próbki supernatantu plwociny przed terapią anty-IL-5, anty-IL5R lub anty-IgE, jak również po 6 miesiącach. Jeśli chodzi o komórki plwociny, pacjenci z dobrej jakości próbkami przed i po terapii pozwolą na analizę ekspresji genów.

Testy immunologiczne: Stężenia mediatorów zawartych w supernatancie plwociny ocenia się za pomocą testu wydajności ELISA Luminex (systemy R i D, Minneapolis, USA) zgodnie z instrukcjami producenta. Przeprowadza się eksperymenty wzbogacania cytokin w supernatantach plwociny, aby sprawdzić, czy odzysk wynosi od 80% do 120% dla wszystkich analitów.

Ekstrakcja RNA i metody RT-qPCR Poziomy białka mediatora zostaną uzyskane przy użyciu zestawu do wykrywania Luminex performance XL (systemy R i D, Minneapolis, USA) dla IL-3 i IL-4 (granica wykrywalności: 0,09 pg/ml dla obu). W przypadku IL-5, IL-13, IL-33 i GM-CSF zostanie użyty zestaw Luminex o wysokiej czułości. Granice wykrywalności wynoszą odpowiednio 0,4, 5,1, 1,8 i 1,6 pg/ml.

Jeśli chodzi o poziomy ekspresji genu mediatora, kroki zostaną wykonane dokładnie tak, jak opisano ostatnio. Wszystkie startery i sondy zostaną uzyskane z IDT (Integrated DNA Technologies, Skokie, IL, USA). Wydajność PCR zostanie obliczona przy użyciu oprogramowania do analizy qbase+ qPCR (Biogazelle, Zwijnaarde, Belgia). Ten sam program zostanie wykorzystany do uzyskania względnej ilościowej oceny ekspresji genów przy użyciu metody 2-∆∆Ct. HPRT1 i GNB2L1 zostaną użyte jako geny referencyjne, jak również wcześniej informowano. Pacjenci zostaną porównani z kohortą 7 zdrowych osób.

Te etapy przeprowadza się zgodnie z opisem da Silva i wsp. [Clin Exp Alergia 2017], z wyjątkiem tego, że etap Taqman PCR przeprowadza się na płytkach 96-dołkowych i że dla każdej próbki stosuje się 2 µl cDNA (rozcieńczonego 1:4) w całkowitej objętości reakcji 12,5 µl, w tym 500 nM startera przedniego, 500 nM startera wstecznego i 250 nM sondy dla wszystkich testowanych genów. Każdy qPCR jest realizowany w dwóch powtórzeniach i zawiera kontrole bez matrycy dla każdego genu. Amplifikację przeprowadza się na aparacie LightCycler 480 Real-Time PCR (Roche, Pleasanton, CA, USA) podczas 45 cykli w następujący sposób: początkowy etap aktywacji: 95°C przez 15 min; etap denaturacji: 94 °C przez 15 s; etap wyżarzania i wydłużania: 60°C przez 1 min. Wszystkie startery i sondy są znakowane barwnikami reporterowymi i podwójnie wygaszającymi 5'6-karboksyfluoresceina/ZEN/3' Iowa black FQ (5'6-FAM/ZEN/3'IBFQ) i zostały otrzymane z IDT (Integrated DNA Technologies, Skokie , Illinois, Stany Zjednoczone). Krzywe wzorcowe są generowane dla każdego genu przy użyciu 4-krotnego seryjnego rozcieńczenia wyjściowego cDNA (pula 4 cDNA) w celu sprawdzenia, czy wszystkie uzyskane wydajności PCR mieszczą się między 1,9 a 2,1. Zanieczyszczenie genomowym DNA jest kontrolowane przez wykonanie qPCR z każdą próbką RNA bez etapu RT. Względne oznaczenie ilościowe ekspresji genów określa się przy użyciu oprogramowania do analizy qbase+ qPCR (Biogazelle, Zwijnaarde, Belgia) przy użyciu metody 2-∆∆Ct. HPRT1 i GNB2L1 stosuje się jako geny odniesienia, jak określono wcześniej. Cała procedura jest wykonywana zgodnie z wytycznymi MIQE dotyczącymi minimum informacji wymaganych do eksperymentu qPCR.

Cytokiny będą również mierzone we krwi podgrupy pacjentów.

Punkty końcowe badania

Główny punkt końcowy:

Identyfikacja predyktorów zmniejszenia częstości zaostrzeń i dawki doustnych kortykosteroidów.

Drugorzędowy punkt końcowy:

Aby zidentyfikować predyktory poprawy w ACQ (-0,5), ACT (+3 pkt.), AQLQ (+ 0,5), eozynofile w plwocinie (<3%), FEV1 (+ 200 ml).

Plan statystyczny lub analiza danych Wyniki zostaną wyrażone jako średnia¡SD lub średnia¡SEM dla zmiennych ciągłych; mediana (zakres) dla rozkładów skośnych. Dla zmiennych kategorycznych w każdej kategorii zostanie podana liczba obserwacji i procenty. Porównania między różnymi podgrupami zostaną przeprowadzone za pomocą testu Kruskala-Wallisa lub testu t dla par / testu rang ze znakiem Wilcoxona. Współczynnik korelacji Spearmana zostanie wykorzystany do pomiaru związku między parametrami klinicznymi.

Obliczenia mocy wskazały wymaganą całkowitą wielkość próby 50 osób, aby potwierdzić zmianę wyników.