Biologisten aineiden vaikutus eosinofiilien vaihtoehtoisiin toimintoihin vaikeassa astmassa

Vaikeaa astmaa havaitaan 3–5 %:lla astmaatikoista, ja sille on ominaista suurempi pahenemisaste, huonosti hallittu astma ja/tai huono keuhkojen toiminta. Viimeisten kymmenen vuoden aikana anti-IgE ja anti-IL5 (ja anti-IL5R) ovat parantaneet huomattavasti vaikean astman tilaa. Hoito kroonisella tai suun kautta otettavalla kortikosteroidihoidolla on todellakin vastuussa monista sivuvaikutuksista. Biomarkkereista puuttuu kuitenkin anti-IL5- ja anti-IgE-vastaanottimien ennustaminen.

Olemme aiemmin havainneet, että ysköksen eosinofiilien määrät ovat hyviä ennustajia vakavien astmaatikoiden keuhkojen toiminnan paranemiselle käyttämällä anti-IL5:tä (Schleich et al, painos Clin Exp Allergy 2020 -julkaisussa). Yskössolut eivät ehkä ole ainoa relevantti ysköksen merkkiaine mepolitsumabille reagoiville.

Tavoitteena on arvioida ysköksen sytokiinien (proteiinitasot ja geenit) (IL-3, IL-4, IL-5, IL-13, IL-33 ja GM-CSF) kykyä ennustaa vaikeiden astmaatikoiden vaste 6 vuoden jälkeen. kuukauden hoito biologisilla lääkkeillä pahenemisvaiheiden ja kortikosteroidien käytön vähentämisen, FEV1:n paranemisen, astman hallinnan, astman elämänlaadun sekä ysköksen ja veren tulehduksen vaikutuksen kannalta.

Liegen CHU:n astmaklinikalla havaitut vaikeat astmaatikot karakterisoidaan erittäin hyvin verinäytteiden, indusoidun ysköksen, keuhkojen toiminnan, FeNO:n, astman kontrollikyselyiden (ACT - ACQ) ja astman elämänlaatukyselyiden (AQLQ) perusteella.

Myös tiedot edellisen vuoden pahenemisvaiheista sekä tämänhetkisistä inhaloiduista ja suun kautta annetuista hoidoista tallennetaan. Jos FEV1-arvo on yli 70 % ennustetusta arvosta, vaikeat astmaatikot suorittavat myös metakoliinihaasteen arvioidakseen keuhkoputkien yliherkkyyttä.

Kaikki nämä toimenpiteet toistetaan 6 kuukauden mepolitsumabihoidon jälkeen. Kaikki ysköksen supernatantit säilytetään -80 °C:ssa ja RNA:ta yskössoluista on myös saatavilla.

Tavoiteotoskoko: 50 potilasta

Aiomme mitata erilaisia ​​sytokiineja ysköksessä (IL3, GM-CSF, IL5, IL-13, IL-33, IL-4…) ja arvioida niiden kykyä ennustaa vaste kuuden kuukauden hoidon jälkeen erilaisilla biologisilla aineilla. pahenemisvaiheiden ja kortikosteroidien käytön väheneminen, FEV1:n (+200 ml) paraneminen, astman hallinta (ACQ:n lasku >0,5, ACT nousu >3), astman elämänlaatu (AQLQ-pistemäärän nousu > 0,5) ja vaikutus yskökseen ja vereen tulehdus.

Astmapotilaita rekrytoidaan poliklinikan ja keuhkokuntoutuskeskuksen (CHU, Sart-Tilman, Liege) kautta. Astma diagnosoidaan GINA-ohjeissa (http://ginasthma.org/) kuvatulla tavalla.

Ysköksen induktio ja käsittely. Yskös indusoidaan ja prosessoidaan aiemmin kuvatulla tavalla (Delvaux Thorax 2014). Koko yskös kerätään muoviastiaan, punnitaan ja homogenoidaan kolmella tilavuudella fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS), vorteksoidaan 30 s ja sentrifugoidaan 800 g:ssä 10 minuuttia 4 °C:ssa. Supernatantti erotetaan solusta. pelletoidaan suodattamalla 2 kerroksen läpi steriiliä sideharsoa. Mukolyysi suoritetaan lisäämällä yhtä suuri tilavuus 6,5 mM ditiotreitolia ja suspensiota heilutellaan 20 minuutin ajan. Kun on sentrifugoitu 10 minuuttia 550 g:llä, levyepiteelisolut ja solujen kokonaismäärä sekä solujen elinkelpoisuus tarkistetaan trypaanisinisellä poissulkemisella manuaalisella hemosytometrillä. Leukosyyttien differentiaalinen määrä suoritetaan sytospineilla, jotka on värjätty May-Grünwald-Giemsalla 500 solulla.

Jos laatukriteerit (< 30 % okasoluista ja elinkelpoisuus > 50 %) täyttyvät, solupelletti sekoitetaan 5 tilavuuteen RNAprotect-solureagenssia (Qiagen, Hilden, Saksa) ja pidetään -80 °C:ssa RNA:n uuttamiseen asti.

Yhteensä analysoidaan 50 potilasta, joilla on onnistuneesti indusoitu yskössupernatantti ennen anti-IL-5-, anti-IL5R- tai anti-IgE-hoitoa sekä 6 kuukautta sen jälkeen. Mitä tulee yskössoluihin, potilaat, joilla on hyvälaatuiset näytteet ennen ja jälkeen hoidon, mahdollistavat geeniekspressioanalyysin.

Immunomääritykset: Ysköksen supernatantin sisältämien välittäjien pitoisuudet arvioidaan ELISA Luminex -suorituskykymäärityksellä (R and D -järjestelmät, Minneapolis, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Sytokiinien lisäyskokeet ysköksen supernatanteissa suoritetaan sen tarkistamiseksi, että saanto on 80-120 % kaikista analyyteistä.

RNA:n uutto- ja RT-qPCR-menetelmät Välittäjäproteiinitasot saadaan käyttämällä Luminex performance XL Discovery Kit (R and D Systems, Minneapolis, USA) IL-3:lle ja IL-4:lle (havaitsemisraja: 0,09 pg/ml molemmille). IL-5:lle, IL-13:lle, IL-33:lle ja GM-CSF:lle käytetään Luminexin korkean herkkyyden suorituskykypakkausta. Havaitsemisrajat ovat 0,4, 5,1, 1,8 ja 1,6 pg/ml.

Mitä tulee välittäjägeenin ilmentymistasoihin, vaiheet suoritetaan täsmälleen äskettäin kuvatulla tavalla. Kaikki alukkeet ja koettimet hankitaan IDT:ltä (Integrated DNA Technologies, Skokie, IL, USA). PCR-tehokkuus lasketaan käyttämällä qbase+ qPCR-analyysiohjelmistoa (Biogazelle, Zwijnaarde, Belgia). Samaa ohjelmaa käytetään geeniekspression suhteellisessa kvantitaatiossa 2-∆∆Ct-menetelmällä. HPRT1:tä ja GNB2L1:tä käytetään vertailugeeneinä, kuten myös aiemmin on raportoitu. Potilaita verrataan 7 terveen henkilön kohorttiin.

Nämä vaiheet suoritetaan da Silvan et al:n [Clin Exp allergia 2017] kuvauksen mukaisesti, paitsi että Taqman PCR -vaihe suoritetaan 96-kuoppalevyillä ja että jokaista näytettä kohti käytetään 2 µl cDNA:ta (laimennettu 1:4). kokonaisreaktiotilavuudessa 12,5 ui, mukaan lukien 500 nM eteenpäin suuntautuva aluke, 500 nM käänteinen aluke ja 250 nM koetin kaikille testatuille geeneille. Jokainen qPCR toteutetaan kahtena kappaleena ja sisältää ei-templaattikontrollit kullekin geenille. Monistaminen suoritetaan LightCycler 480 Real-Time PCR:llä (Roche, Pleasanton, CA, USA) 45 syklin aikana seuraavasti: alkuaktivointivaihe: 95 °C 15 minuuttia; denaturaatiovaihe: 94 °C 15 s; hehkutus- ja pidennysvaihe: 60 °C 1 min. Alukkeet ja koettimet on kaikki leimattu reportteri- ja kaksoissammuttajaväreillä 5'6-karboksifluoreseiini/ZEN/3' Iowa black FQ (5'6-FAM/ZEN/3'IBFQ) ja ne saatiin IDT:ltä (Integrated DNA Technologies, Skokie). IL, USA). Standardikäyrät muodostetaan kullekin geenille käyttämällä 4-kertaista sarjalaimennusta kanta-cDNA:sta (4 cDNA:n pooli) sen tarkistamiseksi, että kaikki saadut PCR-tehokkuudet ovat välillä 1,9-2,1. Genomisen DNA:n kontaminaatiota kontrolloidaan suorittamalla qPCR jokaiselle RNA-näytteelle ilman RT-vaihetta. Geeniekspression suhteellinen kvantitaatio määritetään qbase+ qPCR-analyysiohjelmistolla (Biogazelle, Zwijnaarde, Belgia) 2-∆∆Ct-menetelmällä. HPRT1:tä ja GNB2L1:tä käytetään vertailugeeneinä, kuten aiemmin on määritetty. Kaikki toimenpide suoritetaan MIQE-ohjeiden mukaisesti qPCR-kokeeseen vaadittavien vähimmäistietojen osalta.

Sytokiinit mitataan myös osan potilaiden verestä.

Tutkimuksen päätepisteet

Ensisijainen päätepiste:

Tunnistaa pahenemisvaiheiden ja oraalisten kortikosteroidiannoksen vähenemisen ennustajat.

Toissijainen päätepiste:

Tunnistaaksesi ACQ:n paranemisen ennustajat (-0,5), ACT (+3 pts), AQLQ (+ 0,5), ysköksen eosinofiilit (<3 %), FEV1 (+ 200 ml).

Tilastollinen suunnitelma tai data-analyysi Tulokset ilmaistaan ​​jatkuvien muuttujien keskiarvona¡SD tai keskiarvon¡SEM; mediaani (alue) vinoille jakaumille. Kategoristen muuttujien osalta havaintojen lukumäärä ja prosenttiosuudet ilmoitetaan kussakin luokassa. Vertailut eri alaryhmien välillä suoritetaan Kruskal-Wallis-testillä tai pari-t-testillä / Wilcoxon signed rank -testillä. Spearman-korrelaatiokerrointa käytetään kliinisten parametrien välisen yhteyden mittaamiseen.

Teholaskelmat osoittivat, että vaadittu kokonaisotoskoko oli 50 koehenkilöä tulosten muutoksen vahvistamiseksi.