Efecto de los productos biológicos sobre las funciones alternativas de los eosinófilos en el asma grave

El asma grave se observa en el 3 al 5% de la población asmática y se caracteriza por una mayor tasa de exacerbaciones, asma mal controlada y/o función pulmonar deficiente. Durante los últimos diez años, anti-IgE y anti-IL5 (y anti-IL5R) han mejorado considerablemente el estado del asma grave. El tratamiento con un curso crónico u oral de corticosteroides es de hecho responsable de muchos efectos secundarios. Sin embargo, faltan biomarcadores para la predicción de respondedores a anti-IL5 y anti-IgE.

Hemos encontrado previamente que los recuentos de eosinófilos en el esputo son buenos predictores de la mejora en la función pulmonar de los asmáticos graves que usan anti-IL5 (Schleich et al, en prensa en Clin Exp Allergy 2020). Las células de esputo podrían no ser el único marcador de esputo relevante para los respondedores a mepolizumab.

El objetivo es evaluar la capacidad de las citocinas del esputo (niveles de proteínas y genes) (IL-3, IL-4, IL-5, IL-13, IL-33 y GM-CSF) para predecir la respuesta de los asmáticos graves después de 6 meses de tratamiento con biológicos en términos de reducción de exacerbaciones y uso de corticosteroides, mejora en el FEV1, en el control del asma, en la calidad de vida del asma y el efecto sobre la inflamación del esputo y la sangre.

Los asmáticos graves que se atienden en la Clínica de Asma de CHU de Lieja están muy bien caracterizados mediante la medición inicial de muestras de sangre, esputo inducido, función pulmonar, FeNO, cuestionarios de control del asma (ACT - ACQ) y cuestionarios de calidad de vida del asma (AQLQ).

También se registran los datos de las agudizaciones durante el año anterior y el tratamiento inhalado y oral actual. Si el valor de FEV1 es superior al 70 % del valor predicho, los asmáticos graves también realizan una provocación con metacolina para evaluar la hiperreactividad bronquial.

Todas estas medidas se repiten tras 6 meses de tratamiento con mepolizumab. Todos los sobrenadantes de esputo se almacenan a -80 °C y también está disponible el ARN de las células de esputo.

Tamaño de la muestra objetivo: 50 pacientes

Planeamos medir diferentes citoquinas en el esputo (IL3, GM-CSF, IL5, IL-13, IL-33, IL-4…) y evaluar su capacidad para predecir la respuesta después de 6 meses de tratamiento con diferentes biológicos en términos de reducción de las exacerbaciones y del uso de corticosteroides, mejora del FEV1 (+200 ml), del control del asma (disminución del ACQ > 0,5, aumento del ACT > 3), de la calidad de vida del asma (aumento de la puntuación AQLQ > 0,5) y del efecto sobre el esputo y la sangre inflamación.

Los pacientes asmáticos se reclutan a través de la clínica ambulatoria y el centro de rehabilitación pulmonar (CHU, Sart-Tilman, Lieja). El asma se diagnostica como se describe en las pautas GINA (http://ginasthma.org/).

Inducción y procesamiento de esputo. El esputo se induce y procesa como se describió anteriormente (Delvaux Thorax 2014). Todo el esputo se recoge en un recipiente de plástico, se pesa y se homogeneiza con tres volúmenes de solución salina tamponada con fosfato (PBS), se agita durante 30 s y se centrifuga a 800 g durante 10 min a 4 °C. El sobrenadante se separa de la célula. pellet por filtración a través de 2 capas de gasa estéril. Se realiza una mucólisis añadiendo un volumen igual de ditiotreitol 6,5 mM y se agita la suspensión durante 20 min. Después de una centrifugación de 10 min a 550 g, las células escamosas y los recuentos de células totales, así como la viabilidad celular, se comprueban mediante exclusión con azul de tripano con un hemocitómetro manual. El recuento diferencial de leucocitos se realiza en citospinas teñidas con May-Grünwald-Giemsa en 500 células.

Si se respetan los criterios de calidad (< 30 % de células escamosas y viabilidad > 50 %), el sedimento celular se mezcla con 5 volúmenes de reactivo celular RNAprotect (Qiagen, Hilden, Alemania) y se mantiene a -80 °C hasta la extracción del ARN.

En total, se analizarán 50 pacientes con muestras de sobrenadante de esputo inducido con éxito antes de la terapia con anti-IL-5, anti-IL5R o anti-IgE, así como 6 meses después. En cuanto a las células de esputo, los pacientes con muestras de buena calidad antes y después de la terapia permitirán el análisis de la expresión génica.

Inmunoensayos: Las concentraciones de los mediadores contenidos en el sobrenadante de esputo se evalúan mediante el ensayo de rendimiento ELISA Luminex (R and D Systems, Minneapolis, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se realizan experimentos de adición de citocinas en sobrenadantes de esputo para comprobar que la recuperación está entre el 80 % y el 120 % para todos los analitos.

Métodos de extracción de ARN y RT-qPCR Los niveles de proteína mediadora se obtendrán utilizando el kit de descubrimiento Luminex performance XL (R and D Systems, Minneapolis, EE. UU.) para IL-3 e IL-4 (límite de detección: 0,09 pg/ml para ambos). Se utilizará un kit de rendimiento de alta sensibilidad Luminex para IL-5, IL-13, IL-33 y GM-CSF. Los límites de detección son 0,4, 5,1, 1,8 y 1,6 pg/ml respectivamente.

Con respecto a los niveles de expresión del gen mediador, los pasos se realizarán exactamente como se describió recientemente. Los cebadores y las sondas se obtendrán todos de IDT (Integrated DNA Technologies, Skokie, IL, EE. UU.). Las eficiencias de la PCR se calcularán utilizando el software de análisis qbase+ qPCR (Biogazelle, Zwijnaarde, Bélgica). El mismo programa se utilizará para obtener la cuantificación relativa en la expresión génica mediante el método 2-∆∆Ct. HPRT1 y GNB2L1 se usarán como genes de referencia, como también se informó anteriormente. Los pacientes se compararán con una cohorte de 7 sujetos sanos.

Estos pasos se realizan de acuerdo con la descripción de da Silva et al [Clin Exp Alergia 2017] excepto que el paso Taqman PCR se realiza en placas de 96 pocillos y que para cada muestra se utilizan 2 µl de ADNc (diluido 1:4) en un volumen de reacción total de 12,5 µl que incluye cebador directo 500 nM, cebador inverso 500 nM y sonda 250 nM para todos los genes probados. Cada qPCR se realiza por duplicado e incluye controles sin plantilla para cada gen. La amplificación se realiza en LightCycler 480 Real-Time PCR (Roche, Pleasanton, CA, EE. UU.) durante 45 ciclos de la siguiente manera: paso de activación inicial: 95 °C durante 15 min; etapa de desnaturalización: 94 °C por 15 s; etapa de recocido y elongación: 60 °C durante 1 min. Los cebadores y las sondas están todos marcados con colorantes indicadores y de extinción doble 5'6-carboxifluoresceína/ZEN/3' Iowa black FQ (5'6-FAM/ZEN/3'IBFQ) y se obtuvieron de IDT (Integrated DNA Technologies, Skokie , IL, EE. UU.). Se generan curvas estándar para cada gen utilizando una dilución en serie de 4 veces de cDNA stock (grupo de 4 cDNA) para comprobar que todas las eficiencias de PCR obtenidas están entre 1,9 y 2,1. La contaminación del ADN genómico se controla realizando qPCR con cada muestra de ARN sin paso de RT. La cuantificación relativa en la expresión génica se determina usando el software de análisis qbase+ qPCR (Biogazelle, Zwijnaarde, Bélgica) usando el método 2-∆∆Ct. HPRT1 y GNB2L1 se usan como genes de referencia como se determinó previamente. Todo el procedimiento se realiza de acuerdo con las pautas de MIQE para la información mínima requerida para un experimento de qPCR.

Las citocinas también se medirán en la sangre de un subconjunto de pacientes.

Criterios de valoración del estudio

Variable principal:

Identificar predictores de reducción de exacerbaciones y de dosis de corticoides orales.

Punto final secundario:

Identificar predictores de mejora en ACQ (-0,5), ACT (+3pts), AQLQ (+0,5), eosinófilos en esputo (<3%), FEV1 (+200ml).

Plan Estadístico o Análisis de Datos Los resultados se expresarán como media¡SD o media¡SEM para variables continuas; mediana (rango) para distribuciones asimétricas. Para las variables categóricas se dará el número de observaciones y porcentajes en cada categoría. Las comparaciones entre los diferentes subgrupos se realizarán con una prueba de Kruskal-Wallis o prueba t pareada/prueba de rangos con signos de Wilcoxon. Se utilizará el coeficiente de correlación de Spearman para medir la asociación entre parámetros clínicos.

Los cálculos de potencia indicaron un tamaño de muestra total requerido de 50 sujetos para confirmar un cambio en los resultados.