Effekt av biologiska ämnen på alternativa funktioner hos eosinofiler vid svår astma

Allvarlig astma observeras hos 3 till 5 % av den astmatiska befolkningen och kännetecknas av en högre frekvens av exacerbationer, dåligt kontrollerad astma och/eller dålig lungfunktion. Under de senaste tio åren har anti-IgE och anti-IL5 (och anti-IL5R) avsevärt förbättrat svår astmastatus. Behandling med kronisk eller oral behandling av kortikosteroider är verkligen ansvarig för många biverkningar. Det finns dock en brist på biomarkörer för att förutsäga svar på anti-IL5 och anti-IgE.

Vi har tidigare funnit att antalet eosinofiler i sputum är goda prediktorer för förbättring av lungfunktionen hos svåra astmatiker som använder anti-IL5 (Schleich et al, i press i Clin Exp Allergy 2020). Sputumceller kanske inte är den enda relevanta sputummarkören för personer som svarar på mepolizumab.

Målet är att utvärdera förmågan hos sputumcytokiner (proteinnivåer och gener) (IL-3, IL-4, IL-5, IL-13, IL-33 och GM-CSF) att förutsäga svaret hos svåra astmatiker efter 6 månaders behandling med biologiska läkemedel vad gäller minskning av exacerbationer och kortikosteroidanvändning, förbättring av FEV1, i astmakontroll, i astmalivskvalitet och effekt på sputum och blodinflammation.

Svåra astmatiker som ses på astmakliniken i CHU i Liege är mycket väl karakteriserade med baslinjemätning av blodprover, inducerat sputum, lungfunktion, FeNO, astmakontrollfrågeformulär (ACT - ACQ) och astmakvalitetsfrågor (AQLQ).

Data om exacerbationer under föregående år och aktuell inhalations- och oral behandling registreras också. Om FEV1-värdet är högre än 70 % av det förväntade värdet, utför svåra astmatiker också en metakolinutmaning för att utvärdera bronkial hyperresponsivitet.

Alla dessa åtgärder upprepas efter 6 månaders behandling med mepolizumab. Alla sputumsupernatanterna lagras vid -80°C och RNA från sputumceller finns också tillgängligt.

Målprovstorlek: 50 patienter

Vi planerar att mäta olika cytokiner i sputum (IL3, GM-CSF, IL5, IL-13, IL-33, IL-4...) och att utvärdera deras förmåga att förutsäga svaret efter 6 månaders behandling med olika biologiska läkemedel mht. minskning av exacerbationer och kortikosteroidanvändning, förbättring av FEV1 (+200ml), i astmakontroll (ACQ-minskning >0,5, ACT-ökning >3), i astmalivskvalitet (ökning av AQLQ-poäng > 0,5) och effekten på sputum och blod inflammation.

Astmatiska patienter rekryteras genom polikliniken och lungrehabiliteringscentret (CHU, Sart-Tilman, Liege). Astma diagnostiseras enligt beskrivningen i GINA-riktlinjerna (http://ginasthma.org/).

Sputuminduktion och bearbetning. Sputumet induceras och bearbetas som tidigare beskrivits (Delvaux Thorax 2014). Hela sputumet samlas upp i en plastbehållare, vägs och homogeniseras med tre volymer fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS), vortexas i 30 sekunder och centrifugeras vid 800 g under 10 minuter vid 4°C. Supernatanten separeras från cellen pellet genom filtrering genom 2 lager steril gasväv. En mukolys utförs genom att tillsätta en lika stor volym av 6,5 mM ditiotreitol och suspensionen skakas under 20 minuter. Efter en centrifugering på 10 minuter vid 550 g kontrolleras skivepitelcellerna och det totala cellantalet samt cellviabiliteten genom trypanblått uteslutning med en manuell hemocytometer. Den differentiella leukocyträkningen utförs på cytospin färgade med May-Grünwald-Giemsa på 500 celler.

Om kvalitetskriterierna (< 30 % av skivepitelcellerna och livsduglighet > 50 %) respekteras, blandas cellpelleten med 5 volymer RNAprotect-cellreagens (Qiagen, Hilden, Tyskland) och hålls vid -80 °C tills RNA-extraktion.

Totalt kommer 50 patienter med framgångsrika inducerade sputumsupernatantprover före anti-IL-5, anti-IL5R eller anti-IgE-terapi samt 6 månader efter att analyseras. När det gäller sputumcellerna kommer patienter med prover av god kvalitet före och efter terapi att tillåta genuttrycksanalys.

Immunanalyser: Koncentrationerna av mediatorerna i sputumsupernatanten bedöms med ELISA Luminex prestandaanalys (R- och D-system, Minneapolis, USA) enligt tillverkarens instruktioner. Spetsförsök av cytokiner i sputumsupernatanter utförs för att kontrollera att återvinningen är mellan 80 % och 120 % för alla analyter.

RNA-extraktion och RT-qPCR-metoder Mediatorproteinnivåerna kommer att erhållas med hjälp av Luminex Performance XL Discovery Kit (R- och D-system, Minneapolis, USA) för IL-3 och IL-4 (detektionsgräns: 0,09 pg/ml för båda). Ett Luminex högkänslighetsprestandakit kommer att användas för IL-5, IL-13, IL-33 och GM-CSF. Detektionsgränserna är 0,4, 5,1, 1,8 respektive 1,6 pg/ml.

När det gäller mediatorgenens uttrycksnivåer kommer stegen att utföras exakt som nyligen beskrivits. Primers och prober kommer alla att erhållas från IDT (Integrated DNA Technologies, Skokie, IL, USA). PCR-effektivitet kommer att beräknas med hjälp av qbase+ qPCR-analysmjukvara (Biogazelle, Zwijnaarde, Belgien). Samma program kommer att användas för att erhålla relativ kvantifiering av genuttryck med 2-∆∆Ct-metoden. HPRT1 och GNB2L1 kommer att användas som referensgener som också tidigare rapporterats. Patienterna kommer att jämföras med en kohort av 7 friska försökspersoner.

Dessa steg utförs enligt beskrivningen av da Silva et al [Clin Exp allergi 2017] förutom att Taqman PCR-steget utförs i 96-brunnars plattor och att för varje prov används 2 µl cDNA (utspädd 1:4) i en total reaktionsvolym av 12,5 µl inklusive 500 nM framåtriktad primer, 500 nM omvänd primer och 250 nM prob för alla testade gener. Varje qPCR realiseras i duplikat och inkluderade icke-mallkontroller för varje gen. Amplifiering utförs på LightCycler 480 Real-Time PCR (Roche, Pleasanton, CA, USA) under 45 cykler enligt följande: initialt aktiveringssteg: 95 °C under 15 min; denatureringssteg: 94 °C under 15 s; glödgnings- och töjningssteg: 60 °C i 1 min. Primers och prober är alla märkta med reporter- och dubbelsläckande färgämnen 5'6-karboxifluorescein/ZEN/3' Iowa svart FQ (5'6-FAM/ZEN/3'IBFQ) och erhölls från IDT (Integrated DNA Technologies, Skokie) IL, USA). Standardkurvor genereras för varje gen med användning av en 4 gånger seriell utspädning av stam-cDNA (pool av 4 cDNA) för att kontrollera att alla erhållna PCR-effektiviteter är mellan 1,9 och 2,1. Genomisk DNA-kontamination kontrolleras genom att utföra qPCR med varje RNA-prov utan RT-steg. Relativ kvantifiering av genuttryck bestäms med hjälp av qbase+ qPCR-analysmjukvara (Biogazelle, Zwijnaarde, Belgien) med 2-∆∆Ct-metoden. HPRT1 och GNB2L1 används som referensgener såsom tidigare bestämts. Alla procedurer görs enligt MIQE-riktlinjerna för den minsta information som krävs för ett qPCR-experiment.

Cytokiner kommer också att mätas i blodet hos en undergrupp av patienter.

Studera slutpunkter

Primär slutpunkt:

Att identifiera prediktorer för minskning av exacerbationer och orala kortikosteroiddoser.

Sekundär slutpunkt:

För att identifiera prediktorer för förbättring av ACQ (-0,5), ACT (+3 poäng), AQLQ (+ 0,5), sputum eosinofiler (<3 %), FEV1 (+ 200 ml).

Statistisk plan eller dataanalys Resultaten kommer att uttryckas som medel¡SD eller medel¡SEM för kontinuerliga variabler; median (intervall) för snedfördelningar. För kategoriska variabler kommer antalet observationer och procentsatser att anges i varje kategori. Jämförelser mellan olika undergrupper kommer att utföras med ett Kruskal-Wallis-test eller parat t-test / Wilcoxon signerat rangtest. Spearman-korrelationskoefficienten kommer att användas för att mäta sambandet mellan kliniska parametrar.

Effektberäkningar indikerade en nödvändig total provstorlek på 50 försökspersoner för att bekräfta en förändring i resultaten.