Wirkung von Biologika auf alternative Funktionen von Eosinophilen bei schwerem Asthma

Schweres Asthma wird bei 3 bis 5 % der asthmatischen Bevölkerung beobachtet und ist durch eine höhere Exazerbationsrate, schlecht kontrolliertes Asthma und/oder eine schlechte Lungenfunktion gekennzeichnet. In den letzten zehn Jahren haben Anti-IgE und Anti-IL5 (und Anti-IL5R) den Status von schwerem Asthma erheblich verbessert. Die Behandlung mit chronischen oder oralen Kortikosteroiden ist in der Tat für viele Nebenwirkungen verantwortlich. Es fehlt jedoch an Biomarkern für die Vorhersage von Respondern auf Anti-IL5 und Anti-IgE.

Wir haben zuvor festgestellt, dass die Anzahl der Eosinophilen im Sputum gute Prädiktoren für die Verbesserung der Lungenfunktion von schweren Asthmatikern unter Verwendung von Anti-IL5 sind (Schleich et al., im Druck in Clin Exp Allergy 2020). Sputumzellen sind möglicherweise nicht der einzige relevante Sputummarker für Responder auf Mepolizumab.

Ziel ist es, die Fähigkeit von Sputum-Zytokinen (Proteinspiegel und Gene) (IL-3, IL-4, IL-5, IL-13, IL-33 und GM-CSF) zur Vorhersage der Reaktion schwerer Asthmatiker nach 6 zu bewerten Behandlung mit Biologika im Hinblick auf eine Verringerung der Exazerbationen und des Kortikosteroideinsatzes, eine Verbesserung des FEV1, der Asthmakontrolle, der Asthma-Lebensqualität und der Wirkung auf Sputum und Blutentzündungen.

Schwere Asthmatiker, die in der Asthma-Klinik der CHU in Lüttich behandelt werden, werden sehr gut charakterisiert, indem Basismessungen von Blutproben, induziertem Sputum, Lungenfunktion, FeNO, Fragebögen zur Asthmakontrolle (ACT - ACQ) und Fragebögen zur Asthma-Lebensqualität (AQLQ) verwendet werden.

Daten zu Exazerbationen im Vorjahr und zur aktuellen inhalativen und oralen Behandlung werden ebenfalls erfasst. Wenn der FEV1-Wert über 70 % des vorhergesagten Werts liegt, führen schwere Asthmatiker auch eine Methacholin-Provokation durch, um die bronchiale Hyperreagibilität zu beurteilen.

Alle diese Maßnahmen werden nach 6 Monaten Behandlung mit Mepolizumab wiederholt. Alle Sputumüberstände werden bei -80°C gelagert und RNA aus Sputumzellen ist ebenfalls verfügbar.

Zielstichprobengröße: 50 Patienten

Wir planen, verschiedene Zytokine im Sputum zu messen (IL3, GM-CSF, IL5, IL-13, IL-33, IL-4…) und ihre Fähigkeit zu bewerten, das Ansprechen nach 6-monatiger Behandlung mit verschiedenen Biologika vorherzusagen Verringerung der Exazerbationen und des Kortikosteroideinsatzes, Verbesserung des FEV1 (+200 ml), der Asthmakontrolle (ACQ-Abnahme > 0,5, ACT-Anstieg > 3), der Asthma-Lebensqualität (Anstieg des AQLQ-Scores > 0,5) und der Wirkung auf Sputum und Blut Entzündung.

Asthmapatienten werden über die Ambulanz und das Lungenrehabilitationszentrum (CHU, Sart-Tilman, Lüttich) rekrutiert. Asthma wird wie in den GINA-Leitlinien (http://ginasthma.org/) beschrieben diagnostiziert.

Sputum-Induktion und -Verarbeitung. Das Sputum wird wie zuvor beschrieben induziert und verarbeitet (Delvaux Thorax 2014). Das gesamte Sputum wird in einem Kunststoffbehälter gesammelt, gewogen und mit drei Volumina phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) homogenisiert, 30 s gevortext und 10 min bei 4°C mit 800 g zentrifugiert. Der Überstand wird von der Zelle getrennt Pellet durch Filtration durch 2 Lagen sterile Gaze. Eine Mukolyse wird durch Zugabe eines gleichen Volumens von 6,5 mM Dithiothreitol durchgeführt und die Suspension wird 20 Minuten lang geschüttelt. Nach einer Zentrifugation von 10 min bei 550 g werden die Plattenepithel- und Gesamtzellzahlen sowie die Zellviabilität durch Trypanblau-Ausschluss mit einem manuellen Hämozytometer überprüft. Die differentielle Leukozytenzählung wird an Cytospins durchgeführt, die mit May-Grünwald-Giemsa auf 500 Zellen gefärbt wurden.

Wenn die Qualitätskriterien (< 30 % Plattenepithelzellen und Lebensfähigkeit > 50 %) eingehalten werden, wird das Zellpellet mit 5 Volumina RNAprotect Zellreagenz (Qiagen, Hilden, Deutschland) gemischt und bis zur RNA-Extraktion bei -80 °C aufbewahrt.

Insgesamt werden 50 Patienten mit erfolgreich induzierten Sputum-Überstandsproben vor der Anti-IL-5-, Anti-IL5R- oder Anti-IgE-Therapie sowie 6 Monate danach analysiert. In Bezug auf die Sputumzellen ermöglichen Patienten mit Proben von guter Qualität vor und nach der Therapie eine Genexpressionsanalyse.

Immunoassays: Die Konzentrationen der im Sputumüberstand enthaltenen Mediatoren werden mit dem ELISA Luminex Performance Assay (R and D Systems, Minneapolis, USA) nach Herstellerangaben bestimmt. Spiking-Experimente von Zytokinen in Sputumüberständen werden durchgeführt, um zu überprüfen, ob die Wiederfindung für alle Analyten zwischen 80 % und 120 % liegt.

RNA-Extraktion und RT-qPCR-Methoden Die Mediatorproteinspiegel werden mit dem Luminex Performance XL Discovery Kit (R and D Systems, Minneapolis, USA) für IL-3 und IL-4 (Nachweisgrenze: 0,09 pg/ml für beide) ermittelt. Für IL-5, IL-13, IL-33 und GM-CSF wird ein hochempfindliches Leistungskit von Luminex verwendet. Die Nachweisgrenzen betragen 0,4, 5,1, 1,8 bzw. 1,6 pg/ml.

Bezüglich der Mediatorgen-Expressionsniveaus werden die Schritte genau wie kürzlich beschrieben durchgeführt. Primer und Sonden werden alle von IDT (Integrated DNA Technologies, Skokie, IL, USA) bezogen. Die PCR-Effizienz wird mit der qbase+ qPCR-Analysesoftware (Biogazelle, Zwijnaarde, Belgien) berechnet. Dasselbe Programm wird verwendet, um eine relative Quantifizierung der Genexpression unter Verwendung der 2-∆∆Ct-Methode zu erhalten. HPRT1 und GNB2L1 werden, wie ebenfalls bereits berichtet, als Referenzgene verwendet. Die Patienten werden mit einer Kohorte von 7 gesunden Probanden verglichen.

Diese Schritte werden gemäß der Beschreibung von da Silva et al. [Clin Exp Allergy 2017] durchgeführt, außer dass der Taqman-PCR-Schritt in 96-Well-Platten durchgeführt wird und dass für jede Probe 2 µl cDNA (1:4 verdünnt) verwendet werden in einem Gesamtreaktionsvolumen von 12,5 µl, einschließlich 500 nM Vorwärtsprimer, 500 nM Rückwärtsprimer und 250 nM Sonde für alle getesteten Gene. Jede qPCR wird in zweifacher Ausführung durchgeführt und enthält Nicht-Template-Kontrollen für jedes Gen. Die Amplifikation wird auf dem LightCycler 480 Real-Time PCR (Roche, Pleasanton, CA, USA) während 45 Zyklen wie folgt durchgeführt: anfänglicher Aktivierungsschritt: 95 °C für 15 min; Denaturierungsstufe: 94 °C für 15 s; Glüh- und Elongationsstufe: 60 °C für 1 min. Primer und Sonden sind alle mit Reporter- und Doppel-Quencher-Farbstoffen 5'6-Carboxyfluorescein/ZEN/3' Iowa Black FQ (5'6-FAM/ZEN/3'IBFQ) markiert und wurden von IDT (Integrated DNA Technologies, Skokie , Il, USA). Standardkurven werden für jedes Gen unter Verwendung einer 4-fachen Reihenverdünnung von Stamm-cDNA (Pool von 4 cDNA) erstellt, um zu überprüfen, ob alle erhaltenen PCR-Effizienzen zwischen 1,9 und 2,1 liegen. Die genomische DNA-Kontamination wird kontrolliert, indem qPCR mit jeder RNA-Probe ohne RT-Schritt durchgeführt wird. Die relative Quantifizierung der Genexpression wird unter Verwendung der qbase+ qPCR-Analysesoftware (Biogazelle, Zwijnaarde, Belgien) unter Verwendung der 2-∆∆Ct-Methode bestimmt. HPRT1 und GNB2L1 werden wie zuvor bestimmt als Referenzgene verwendet. Das gesamte Verfahren wird gemäß den MIQE-Richtlinien für die Mindestinformationen durchgeführt, die für ein qPCR-Experiment erforderlich sind.

Zytokine werden auch im Blut einer Untergruppe von Patienten gemessen.

Studienendpunkte

Primärer Endpunkt:

Identifizierung von Prädiktoren für eine Verringerung der Exazerbationen und der Dosis oraler Kortikosteroide.

Sekundärer Endpunkt:

Um Prädiktoren für eine Verbesserung des ACQ (-0,5) zu identifizieren, ACT (+3 Punkte), AQLQ (+ 0,5), Eosinophile im Sputum (< 3 %), FEV1 (+ 200 ml).

Statistischer Plan oder Datenanalyse Die Ergebnisse werden als Mittelwert¡SD oder Mittelwert¡SEM für kontinuierliche Variablen ausgedrückt; Median (Bereich) für schiefe Verteilungen. Bei kategorialen Variablen werden die Anzahl der Beobachtungen und Prozentsätze in jeder Kategorie angegeben. Vergleiche zwischen verschiedenen Untergruppen werden mit einem Kruskal-Wallis-Test oder einem gepaarten t-Test / Wilcoxon-Vorzeichen-Rang-Test durchgeführt. Der Spearman-Korrelationskoeffizient wird verwendet, um die Assoziation zwischen klinischen Parametern zu messen.

Power-Berechnungen zeigten eine erforderliche Gesamtstichprobengröße von 50 Probanden, um eine Änderung der Ergebnisse zu bestätigen.