Biológiai szerek hatása az eozinofilek alternatív funkcióira súlyos asztmában

Súlyos asztmát az asztmás populáció 3-5%-ánál figyeltek meg, és az exacerbációk magasabb aránya, a rosszul kontrollált asztma és/vagy a rossz tüdőfunkció jellemzi. Az elmúlt tíz év során az anti-IgE és az anti-IL5 (és az anti-IL5R) jelentősen javította a súlyos asztma állapotát. A krónikus vagy orális kortikoszteroid kezelés valóban sok mellékhatásért felelős. Hiányoznak azonban a biomarkerek az anti-IL5-re és anti-IgE-re reagálók előrejelzésére.

Korábban azt tapasztaltuk, hogy a köpetben mért eozinofilszám jó előrejelzője a súlyos asztmás betegek tüdőfunkciójának javulásának anti-IL5 alkalmazásával (Schleich és munkatársai, a Clin Exp Allergy 2020-ban). Előfordulhat, hogy a köpetsejtek nem az egyetlen releváns köpetmarker a mepolizumabra reagálók számára.

A cél a köpet citokinek (fehérjeszintek és gének) (IL-3, IL-4, IL-5, IL-13, IL-33 és GM-CSF) azon képességének értékelése, hogy előre jelezzék a súlyos asztmás betegek válaszát 6 év után. hónapos biológiai kezelés az exacerbációk és a kortikoszteroid-használat csökkentése, a FEV1 javulása, az asztma kontrollja, az asztmás életminőség, valamint a köpetre és a vérgyulladásra gyakorolt ​​hatása tekintetében.

A Liege-i CHU asztmaklinikáján észlelt súlyos asztmás betegek nagyon jól jellemezhetők a vérminták, az indukált köpet, a tüdőfunkció, a FeNO, az asztma kontroll kérdőívek (ACT - ACQ) és az asztmás életminőség kérdőívek (AQLQ) alapján.

Rögzítésre kerülnek az előző évi exacerbációk és a jelenlegi inhalációs és szájon át történő kezelések adatai is. Ha a FEV1 érték meghaladja az előrejelzett érték 70%-át, a súlyos asztmás betegek metakolin-terhelést is végeznek a hörgő túlérzékenységének értékelésére.

Mindezeket az intézkedéseket 6 hónapos mepolizumab-kezelés után meg kell ismételni. Az összes köpet felülúszót -80 °C-on tárolják, és a köpetsejtekből származó RNS is rendelkezésre áll.

Célmintanagyság: 50 beteg

Azt tervezzük, hogy megmérjük a köpetben lévő különböző citokineket (IL3, GM-CSF, IL5, IL-13, IL-33, IL-4…), és értékeljük, hogy képesek-e megjósolni a válaszreakciót 6 hónapos, különböző biológiai szerekkel végzett kezelés után. az exacerbációk és a kortikoszteroid-használat csökkenése, a FEV1 javulása (+200 ml), az asztmakontroll (ACQ csökkenés >0,5, ACT növekedés >3), az asztmás életminőség (az AQLQ pontszám emelkedése > 0,5) és a köpetre és a vérre gyakorolt ​​hatás gyulladás.

Az asztmás betegeket az ambuláns klinikán és a tüdőrehabilitációs központon (CHU, Sart-Tilman, Liege) keresztül toborozzák. Az asztmát a GINA irányelveiben leírtak szerint diagnosztizálják (http://ginasthma.org/).

A köpet indukciója és feldolgozása. A köpet indukálása és feldolgozása a korábban leírtak szerint történik (Delvaux Thorax 2014). Az egész köpetet műanyag edénybe gyűjtjük, lemérjük, három térfogat foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS) homogenizáljuk, 30 másodpercig vortexeljük, majd 800 g-vel 10 percig 4 °C-on centrifugáljuk. A felülúszót elválasztjuk a sejttől. pelletet 2 réteg steril gézen szűréssel. A mukolízist azonos térfogatú 6,5 mM ditiotreit hozzáadásával hajtjuk végre, és a szuszpenziót 20 percig rázzuk. 10 perces, 550 g-vel végzett centrifugálás után a laphámsejteket és az összes sejtszámot, valamint a sejtek életképességét tripánkék kizárással, kézi hemocitométerrel ellenőrizzük. A differenciális leukocitaszámot May-Grünwald-Giemsa-val festett citoszpineken végezzük 500 sejten.

Ha a minőségi kritériumokat (< 30% laphámsejtek és életképesség > 50%) tiszteletben tartják, a sejtpelletet 5 térfogat RNAprotect sejtreagenssel (Qiagen, Hilden, Németország) összekeverik, és -80 °C-on tartják az RNS extrakcióig.

Összesen 50 olyan beteget elemeznek, akiknél sikeresen indukált köpet felülúszót vettek az anti-IL-5, anti-IL5R vagy anti-IgE terápia előtt, valamint 6 hónappal azután. A köpetsejtek tekintetében a terápia előtt és után jó minőségű mintákkal rendelkező betegek génexpressziós elemzést tesznek lehetővé.

Immunoassays: A köpet felülúszójában lévő mediátorok koncentrációját ELISA Luminex teljesítményvizsgálattal (R and D Systems, Minneapolis, USA) értékeljük a gyártó utasításai szerint. A citokinek spiking kísérleteit köpet felülúszóban végezzük annak ellenőrzésére, hogy a visszanyerés 80% és 120% között van-e az összes analit esetében.

RNS extrakciós és RT-qPCR módszerek A mediátor fehérjeszinteket a Luminex performance XL Discovery Kit (R and D Systems, Minneapolis, USA) segítségével határozzuk meg az IL-3 és az IL-4 esetében (kimutatási határ: 0,09 pg/ml mindkettőnél). Az IL-5, IL-13, IL-33 és GM-CSF esetében egy Luminex nagy érzékenységű teljesítménykészletet kell használni. A kimutatási határok rendre 0,4, 5,1, 1,8 és 1,6 pg/ml.

A mediátor gén expressziós szintjeit illetően a lépéseket pontosan a közelmúltban leírtak szerint hajtjuk végre. A primereket és próbákat az IDT-től (Integrated DNA Technologies, Skokie, IL, USA) szerezzük be. A PCR hatékonyságát a qbase+ qPCR elemző szoftverrel (Biogazelle, Zwijnaarde, Belgium) számítjuk ki. Ugyanezt a programot használjuk a génexpresszió relatív mennyiségi meghatározására a 2-∆∆Ct módszerrel. A HPRT1-et és a GNB2L1-et referenciagénként használjuk, amint azt korábban is közöltük. A betegeket 7 egészséges alanyból álló csoporttal hasonlítják össze.

Ezeket a lépéseket da Silva és munkatársai [Clin Exp allergia 2017] leírása szerint hajtják végre, kivéve, hogy a Taqman PCR lépést 96 lyukú lemezeken hajtják végre, és minden mintához 2 µl cDNS-t (1:4 hígítással) használnak. 12,5 µl teljes reakciótérfogatban, beleértve az 500 nM forward primert, 500 nM reverz primert és 250 nM próbát az összes vizsgált génre. Minden qPCR-t duplikátumban valósítanak meg, és minden génhez tartalmazzák a nem templát kontrollokat. Az amplifikációt LightCycler 480 Real-Time PCR-rel (Roche, Pleasanton, CA, USA) végezzük 45 cikluson keresztül az alábbiak szerint: kezdeti aktiválási lépés: 95 °C 15 percig; denaturációs szakasz: 94 °C 15 másodpercig; lágyítási és megnyújtási szakasz: 60 °C 1 percig. A primerek és próbák mindegyike 5'6-karboxifluoreszcein/ZEN/3' Iowa black FQ (5'6-FAM/ZEN/3'IBFQ) riporter és kettős kioltó festékekkel van megjelölve, és az IDT-től (Integrated DNA Technologies, Skokie) szerezték be. , IL, USA). Minden egyes génhez standard görbéket hozunk létre a törzs-cDNS 4-szeres sorozathígításával (4 cDNS-es pool), hogy ellenőrizzük, hogy az összes kapott PCR hatékonyság 1,9 és 2,1 között van. A genomi DNS-szennyeződés ellenőrzése qPCR végrehajtásával minden RNS-mintával RT lépés nélkül történik. A génexpresszió relatív mennyiségét a qbase+ qPCR elemző szoftverrel (Biogazelle, Zwijnaarde, Belgium) határozzuk meg a 2-∆∆Ct módszerrel. A HPRT1-et és a GNB2L1-et referenciagénként használjuk, amint azt korábban meghatároztuk. Az összes eljárást a MIQE irányelveinek megfelelően hajtják végre a qPCR-kísérlethez szükséges minimális információk tekintetében.

A citokineket a betegek egy részének vérében is mérik.

Végpontok tanulmányozása

Elsődleges végpont:

Az exacerbációk és az orális kortikoszteroid dózisok csökkenésének előrejelzőinek azonosítása.

Másodlagos végpont:

Az ACQ (-0,5) javulásának előrejelzőinek azonosítása, ACT (+3 pont), AQLQ (+ 0,5), köpet eozinofilek (<3%), FEV1 (+ 200 ml).

Statisztikai terv vagy adatelemzés Az eredményeket a folytonos változók átlag¡SD vagy átlag¡SEM értékében kell kifejezni; medián (tartomány) ferde eloszlások esetén. A kategorikus változók esetében az egyes kategóriákban meg kell adni a megfigyelések számát és százalékos arányát. A különböző alcsoportok összehasonlítása Kruskal-Wallis teszttel vagy páros t-teszttel / Wilcoxon aláírt rang teszttel történik. A Spearman-korrelációs együtthatót a klinikai paraméterek közötti összefüggés mérésére használjuk.

A teljesítményszámítások azt mutatták, hogy a szükséges teljes mintanagyság 50 alany volt, hogy megerősítsék az eredmények változását.