Effekt av biologiske stoffer på alternative funksjoner til eosinofiler ved alvorlig astma

Alvorlig astma er observert hos 3 til 5 % av den astmatiske befolkningen og er preget av en høyere forekomst av eksaserbasjoner, dårlig kontrollert astma og/eller dårlig lungefunksjon. I løpet av de siste ti årene har anti-IgE og anti-IL5 (og anti-IL5R) forbedret alvorlig astmastatus betydelig. Behandling med kronisk eller oral behandling med kortikosteroider er faktisk ansvarlig for mange bivirkninger. Det er imidlertid mangel på biomarkører for prediksjon av respondere på anti-IL5 og anti-IgE.

Vi har tidligere funnet at sputum eosinofiltall er gode prediktorer for forbedring av lungefunksjonen til alvorlige astmatikere ved bruk av anti-IL5 (Schleich et al, i trykken i Clin Exp Allergy 2020). Sputumceller er kanskje ikke den eneste relevante sputummarkøren for respondere på mepolizumab.

Målet er å evaluere evnen til sputumcytokiner (proteinnivåer og gener) (IL-3, IL-4, IL-5, IL-13, IL-33 og GM-CSF) til å forutsi responsen til alvorlige astmatikere etter 6. måneders behandling med biologiske legemidler når det gjelder reduksjon av eksaserbasjoner og kortikosteroidbruk, bedring av FEV1, i astmakontroll, i astma-livskvalitet og effekt på oppspytt og blodbetennelse.

Alvorlige astmatikere sett i astmaklinikken ved CHU i Liege er meget godt karakterisert ved å bruke baseline-måling av blodprøver, indusert sputum, lungefunksjon, FeNO, astmakontrollspørreskjemaer (ACT - ACQ) og astmakvalitetsspørreskjemaer (AQLQ).

Data om eksaserbasjoner i løpet av det foregående året og nåværende inhalasjons- og oralbehandling er også registrert. Hvis FEV1-verdien er høyere enn 70 % av den predikerte verdien, utfører alvorlige astmatikere også en metakolin-utfordring for å evaluere bronkial hyperrespons.

Alle disse tiltakene gjentas etter 6 måneders behandling med mepolizumab. Alle sputumsupernatantene lagres ved -80°C og RNA fra sputumceller er også tilgjengelig.

Målprøvestørrelse: 50 pasienter

Vi planlegger å måle ulike cytokiner i sputum (IL3, GM-CSF, IL5, IL-13, IL-33, IL-4...) og å evaluere deres evne til å forutsi responsen etter 6 måneders behandling med ulike biologiske midler mht. reduksjon i eksaserbasjoner og kortikosteroidbruk, bedring i FEV1 (+200ml), i astmakontroll (ACQ-reduksjon >0,5, ACT-økning >3), i astma-livskvalitet (økning i AQLQ-score > 0,5) og effekt på sputum og blod betennelse.

Astmatiske pasienter rekrutteres gjennom poliklinikken og lungerehabiliteringssenteret (CHU, Sart-Tilman, Liege). Astma diagnostiseres som beskrevet i GINA-retningslinjene (http://ginasthma.org/).

Sputum induksjon og prosessering. Sputumet induseres og behandles som tidligere beskrevet (Delvaux Thorax 2014). Hele sputumet samles i en plastbeholder, veies og homogeniseres med tre volumer fosfatbufret saltvann (PBS), virvles i 30 s og sentrifugeres ved 800 g i 10 minutter ved 4°C. Supernatanten separeres fra cellen pellet ved filtrering gjennom 2 lag sterilt gasbind. En mukolyse utføres ved å tilsette et likt volum av 6,5 mM ditiotreitol og suspensjonen rystes i løpet av 20 minutter. Etter en sentrifugering på 10 minutter ved 550g, kontrolleres plateepitelcellene og det totale celletall samt cellelevedyktighet ved trypanblått eksklusjon med et manuelt hemocytometer. Den differensielle leukocytttellingen utføres på cytospin farget med May-Grünwald-Giemsa på 500 celler.

Hvis kvalitetskriteriene (< 30 % av plateepitelceller og levedyktighet > 50 %) blir overholdt, blandes cellepelleten med 5 volumer RNAprotect-cellereagens (Qiagen, Hilden, Tyskland) og holdes ved -80 °C frem til RNA-ekstraksjon.

Totalt vil 50 pasienter med vellykkede induserte sputumsupernatantprøver før anti-IL-5, anti-IL5R eller anti-IgE-behandling samt 6 måneder etter analyseres. Når det gjelder sputumcellene, vil pasienter med prøver av god kvalitet før og etter terapi tillate genekspresjonsanalyse.

Immunanalyser: Konsentrasjonene av mediatorene i sputumsupernatanten vurderes med ELISA Luminex ytelsesanalyse (R- og D-systemer, Minneapolis, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Spiking-eksperimenter av cytokiner i sputumsupernatanter utføres for å kontrollere at gjenvinningen er mellom 80 % og 120 % for alle analyttene.

RNA-ekstraksjon og RT-qPCR-metoder Mediatorproteinnivåene vil bli oppnådd ved å bruke Luminex performance XL oppdagelsessett (R- og D-systemer, Minneapolis, USA) for IL-3 og IL-4 (deteksjonsgrense: 0,09 pg/ml for begge). Et Luminex høysensitiv ytelsessett vil bli brukt for IL-5, IL-13, IL-33 og GM-CSF. Deteksjonsgrenser er henholdsvis 0,4, 5,1, 1,8 og 1,6 pg/ml.

Når det gjelder mediatorgenekspresjonsnivåene, vil trinnene utføres nøyaktig som nylig beskrevet. Primere og prober vil alle fås fra IDT (Integrated DNA Technologies, Skokie, IL, USA). PCR-effektivitet vil bli beregnet ved hjelp av qbase+ qPCR-analyseprogramvare (Biogazelle, Zwijnaarde, Belgia). Det samme programmet vil bli brukt for å oppnå relativ kvantifisering i genuttrykk ved bruk av 2-∆∆Ct-metoden. HPRT1 og GNB2L1 vil bli brukt som referansegener som også tidligere rapportert. Pasientene vil bli sammenlignet med en kohort på 7 friske forsøkspersoner.

Disse trinnene utføres i henhold til beskrivelsen av da Silva et al [Clin Exp allergi 2017] bortsett fra at Taqman PCR-trinnet utføres i 96-brønners plater og at det for hver prøve brukes 2 µl cDNA (fortynnet 1:4) i et totalt reaksjonsvolum på 12,5 µl inkludert 500 nM foroverprimer, 500 nM revers primer og 250 nM probe for alle de testede genene. Hver qPCR er realisert i duplikat og inkluderte ikke-malkontroller for hvert gen. Amplifikasjon utføres på LightCycler 480 Real-Time PCR (Roche, Pleasanton, CA, USA) i løpet av 45 sykluser som følger: innledende aktiveringstrinn: 95 °C i 15 minutter; denatureringstrinn: 94 °C i 15 s; gløde- og forlengelsestrinn: 60 °C i 1 min. Primere og prober er alle merket med reporter- og double-quencher fargestoffer 5'6-carboxyfluorescein/ZEN/3' Iowa black FQ (5'6-FAM/ZEN/3'IBFQ) og ble hentet fra IDT (Integrated DNA Technologies, Skokie) IL, USA). Standardkurver genereres for hvert gen ved å bruke en 4 ganger seriefortynning av stam-cDNA (pool av 4 cDNA) for å kontrollere at all oppnådd PCR-effektivitet er mellom 1,9 og 2,1. Genomisk DNA-kontaminering kontrolleres ved å utføre qPCR med hver RNA-prøve uten RT-trinn. Relativ kvantifisering i genuttrykk bestemmes ved bruk av qbase+ qPCR-analyseprogramvare (Biogazelle, Zwijnaarde, Belgia) ved bruk av 2-∆∆Ct-metoden. HPRT1 og GNB2L1 brukes som referansegener som tidligere bestemt. All prosedyre gjøres i henhold til MIQE-retningslinjene for minimumsinformasjonen som kreves for et qPCR-eksperiment.

Cytokiner vil også bli målt i blodet til en undergruppe av pasienter.

Studie endepunkter

Primært endepunkt:

For å identifisere prediktorer for reduksjon i eksaserbasjoner og i orale kortikosteroiddoser.

Sekundært endepunkt:

For å identifisere prediktorer for forbedring i ACQ (-0,5), ACT (+3 poeng), AQLQ (+ 0,5), sputum eosinofiler (<3%), FEV1 (+ 200ml).

Statistisk plan eller dataanalyse Resultatene vil bli uttrykt som gjennomsnitt ¡SD eller gjennomsnitt ¡SEM for kontinuerlige variabler; median (område) for skjeve fordelinger. For kategoriske variabler vil antall observasjoner og prosenter oppgis i hver kategori. Sammenligninger mellom ulike undergrupper vil bli utført med en Kruskal-Wallis test eller paret t-test / Wilcoxon signert rangtest. Spearman-korrelasjonskoeffisienten vil bli brukt for å måle sammenhengen mellom kliniske parametere.

Effektberegninger indikerte en nødvendig total prøvestørrelse på 50 forsøkspersoner for å bekrefte en endring i resultatene.