重度の喘息における好酸球の代替機能に対する生物製剤の効果

重度の喘息は、喘息患者集団の 3 ～ 5% で観察され、増悪率が高く、喘息のコントロール不良および/または肺機能の低下を特徴としています。 過去 10 年間で、抗 IgE および抗 IL5 (および抗 IL5R) により、重度の喘息の状態が大幅に改善されました。 コルチコステロイドの慢性または経口コースによる治療は、確かに多くの副作用の原因です. しかし、抗 IL5 および抗 IgE に対するレスポンダーを予測するためのバイオマーカーが不足しています。

以前に、喀痰中の好酸球数が、抗 IL5 を使用した重度の喘息患者の肺機能の改善の優れた予測因子であることを発見しました (Schleich et al, in press in Clin Exp Allergy 2020)。 喀痰細胞は、メポリズマブへのレスポンダーに関連する唯一の喀痰マーカーではないかもしれません。

目的は、喀痰のサイトカイン (タンパク質レベルと遺伝子) (IL-3、IL-4、IL-5、IL-13、IL-33、および GM-CSF) が 6 時間後の重度の喘息患者の反応を予測する能力を評価することです。増悪とコルチコステロイド使用の減少、FEV1の改善、喘息のコントロール、喘息の生活の質、および喀痰と血液の炎症への影響に関して、生物学的製剤による数か月の治療。

リエージュの CHU の喘息クリニックで見られる重度の喘息患者は、血液サンプル、誘発喀痰、肺機能、FeNO、喘息コントロール質問票 (ACT - ACQ) および喘息生活の質質問票 (AQLQ) のベースライン測定値を使用して非常によく特徴付けられます。

前年の増悪と現在の吸入および経口治療に関するデータも記録されています。 FEV1 値が予測値の 70% を超える場合、重度の喘息患者は気管支過敏性を評価するためにメタコリン チャレンジも行います。

これらすべての措置は、メポリズマブによる 6 か月の治療後に繰り返されます。 すべての喀痰上清は-80°Cで保存され、喀痰細胞からのRNAも利用できます。

対象サンプルサイズ: 50 人の患者

喀痰中のさまざまなサイトカイン (IL3、GM-CSF、IL5、IL-13、IL-33、IL-4…) を測定し、さまざまな生物学的製剤による 6 か月間の治療後の反応を予測する能力を評価する予定です。増悪とコルチコステロイド使用の減少、FEV1 (+200ml) の改善、喘息コントロール (ACQ 減少 > 0.5、ACT 増加 > 3)、喘息の生活の質 (AQLQ スコアの増加 > 0.5) および喀痰と血液への影響炎症。

喘息患者は、外来診療所および肺リハビリテーション センター (CHU、Sart-Tilman、Liege) を通じて募集されます。 喘息は、GINA ガイドライン (http://ginasthma.org/) に記載されているように診断されます。

喀痰誘導および処理。 喀痰は、前述のように誘導および処理されます (Delvaux Thorax 2014)。 喀痰全体をプラスチック容器に集め、秤量し、3 倍容のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) でホモジナイズし、30 秒間ボルテックスし、800 g で 10 分間、4°C で遠心分離します。上清を細胞から分離します。滅菌ガーゼの 2 層を介したろ過によるペレット。 等量の 6.5 mM ジチオスレイトールを加えて粘液溶解を行い、懸濁液を 20 分間揺り動かす。 ５５０ｇで１０分間遠心分離した後、手動血球計を用いたトリパンブルー排除により、扁平上皮細胞および全細胞数ならびに細胞生存率をチェックする。 白血球の分別カウントは、500 細胞の May-Grünwald-Giemsa で染色されたサイトスピンで実行されます。

品質基準 (< 扁平上皮細胞の 30% および生存率 > 50%) が尊重される場合、細胞ペレットを 5 ボリュームの RNAprotect 細胞試薬 (Qiagen、ヒルデン、ドイツ) と混合し、RNA 抽出まで-80 ° C に保ちます。

合計で、抗IL-5、抗IL5R、または抗IgE療法の前、および6か月後の誘発喀痰上清サンプルが成功した50人の患者が分析されます。 喀痰細胞に関しては、治療前後のサンプルが良好な患者は、遺伝子発現解析を行うことができます。

イムノアッセイ：メーカーの説明書に従って、喀痰上清に含まれるメディエーターの濃度を ELISA Luminex パフォーマンスアッセイ (R and D systems、ミネアポリス、米国) で評価します。 喀痰上清中のサイトカインのスパイク実験を実施して、すべての検体の回収率が 80% から 120% であることを確認します。

RNA 抽出および RT-qPCR 法 メディエータータンパク質レベルは、IL-3 および IL-4 の Luminex performance XL Discovery Kit (R and D systems、ミネアポリス、米国) を使用して取得されます (検出限界: 両方とも 0.09 pg/ml)。 Luminex 高感度パフォーマンス キットは、IL-5、IL-13、IL-33、および GM-CSF に使用されます。 検出限界は、それぞれ 0.4、5.1、1.8、1.6 pg/ml です。

メディエーター遺伝子の発現レベルに関しては、手順は最近説明したとおりに正確に実行されます。 プライマーおよびプローブはすべて、IDT (Integrated DNA Technologies, Skokie, IL, USA) から入手します。 PCR効率は、qbase+ qPCR分析ソフトウェア(Biogazelle、Zwijnaarde、ベルギー)を使用して計算されます。 同じプログラムを使用して、2-ΔΔCt メソッドを使用して遺伝子発現の相対定量を取得します。 HPRT1 と GNB2L1 は、以前にも報告されている参照遺伝子として使用されます。 患者は、7人の健康な被験者のコホートと比較されます。

これらのステップは、Taqman PCR ステップが 96 ウェル プレートで実行され、各サンプルに対して 2 μl の cDNA (1:4 希釈) が使用されることを除いて、da Silva ら [Clin Exp allergy 2017] の説明に従って実行されます。 500 nM フォワード プライマー、500 nM リバース プライマー、250 nM プローブを含む 12.5 μl の総反応量で、すべてのテスト済み遺伝子に対応します。 すべての qPCR は複製で実現され、各遺伝子の非テンプレート コントロールが含まれています。 増幅は、次のように 45 サイクルの間に LightCycler 480 リアルタイム PCR (Roche、プレザントン、カリフォルニア州、米国) で実行されます。初期活性化ステップ: 95 °C で 15 分間。変性段階: 15 秒間 94 °C。アニーリングおよび伸長段階: 60 °C で 1 分間。 プライマーとプローブはすべて、レポーターおよび二重クエンチャー色素 5'6-カルボキシフルオレセイン/ZEN/3' アイオワ ブラック FQ (5'6-FAM/ZEN/3'IBFQ) で標識されており、IDT (Integrated DNA Technologies、Skokie) から入手しました。 、イリノイ州、米国）。 得られたすべての PCR 効率が 1.9 ～ 2.1 であることを確認するために、ストック cDNA の 4 倍連続希釈 (4 つの cDNA のプール) を使用して各遺伝子の標準曲線を作成します。 ゲノム DNA の混入は、RT ステップなしで各 RNA サンプルで qPCR を実行することによって制御されます。 遺伝子発現の相対定量は、qbase+ qPCR 分析ソフトウェア (Biogazelle、Zwijnaarde、ベルギー) を使用して、2-ΔΔCt 法を使用して決定されます。 HPRT1 および GNB2L1 は、以前に決定された参照遺伝子として使用されます。 すべての手順は、qPCR 実験に必要な最小限の情報について MIQE ガイドラインに従って行われます。

患者のサブセットの血液中のサイトカインも測定されます。

調査のエンドポイント

一次エンドポイント:

増悪および経口コルチコステロイド用量の減少の予測因子を特定すること。

二次エンドポイント:

ACQ (-0.5) の改善の予測因子を特定するには、 ACT (+3pts)、AQLQ (+ 0.5)、喀痰好酸球 (<3%)、FEV1 (+ 200ml)。

統計計画またはデータ分析 結果は、連続変数の平均±SDまたは平均±SEMとして表されます。歪んだ分布の中央値 (範囲)。 カテゴリ変数の場合、観測数とパーセンテージが各カテゴリに表示されます。 異なるサブグループ間の比較は、Kruskal-Wallis 検定または対応のある t 検定 / Wilcoxon 符号順位検定を使用して実行されます。 スピアマン相関係数は、臨床パラメーター間の関連性を測定するために使用されます。

検出力の計算では、結果の変化を確認するために必要な合計サンプル サイズは 50 人であることが示されました。