Efeito de produtos biológicos em funções alternativas de eosinófilos na asma grave

A asma grave é observada em 3 a 5% da população asmática e é caracterizada por uma taxa mais elevada de exacerbações, asma mal controlada e/ou função pulmonar deficiente. Durante os últimos dez anos, anti-IgE e anti-IL5 (e anti-IL5R) melhoraram consideravelmente o estado de asma grave. O tratamento com corticosteróides crônicos ou orais é de fato responsável por muitos efeitos colaterais. No entanto, faltam biomarcadores para a previsão de respostas a anti-IL5 e anti-IgE.

Descobrimos anteriormente que as contagens de eosinófilos no escarro são bons preditores de melhora na função pulmonar de asmáticos graves usando anti-IL5 (Schleich et al, no prelo em Clin Exp Allergy 2020). As células de escarro podem não ser o único marcador de escarro relevante para respondedores ao mepolizumabe.

O objetivo é avaliar a capacidade das citocinas do escarro (níveis de proteínas e genes) (IL-3, IL-4, IL-5, IL-13, IL-33 e GM-CSF) em predizer a resposta de asmáticos graves após 6 meses de tratamento com biológicos em termos de redução das exacerbações e do uso de corticosteróides, melhoria do VEF1, do controlo da asma, da qualidade de vida da asma e do efeito na expectoração e na inflamação sanguínea.

Os asmáticos graves atendidos na Clínica de Asma do CHU de Liège são muito bem caracterizados por meio de medidas basais de amostras de sangue, escarro induzido, função pulmonar, FeNO, questionários de controle da asma (ACT - ACQ) e questionários de qualidade de vida da asma (AQLQ).

Dados sobre exacerbações durante o ano anterior e tratamento inalatório e oral atual também são registrados. Se o valor do VEF1 for superior a 70% do valor previsto, os asmáticos graves também realizam um desafio com metacolina para avaliar a hiperresponsividade brônquica.

Todas essas medidas são repetidas após 6 meses de tratamento com mepolizumabe. Todos os sobrenadantes do escarro são armazenados a -80°C e o RNA das células do escarro também está disponível.

Tamanho da amostra alvo: 50 pacientes

Pretendemos medir diferentes citocinas no escarro (IL3, GM-CSF, IL5, IL-13, IL-33, IL-4…) e avaliar sua capacidade de prever a resposta após 6 meses de tratamento com diferentes biológicos em termos de redução das exacerbações e do uso de corticosteroides, melhora do VEF1 (+200ml), do controle da asma (diminuição do ACQ >0,5, aumento do ACT >3), da qualidade de vida da asma (aumento do escore do AQLQ > 0,5) e do efeito no escarro e no sangue inflamação.

Os pacientes asmáticos são recrutados através do ambulatório e do centro de reabilitação pulmonar (CHU, Sart-Tilman, Liege). A asma é diagnosticada conforme descrito nas diretrizes da GINA (http://ginasthma.org/).

Indução e processamento de escarro. O escarro é induzido e processado conforme descrito anteriormente (Delvaux Thorax 2014). Todo o escarro é coletado em um recipiente plástico, pesado e homogeneizado com três volumes de solução salina tamponada com fosfato (PBS), agitado em vórtex por 30 s e centrifugado a 800 g por 10 min a 4° C. O sobrenadante é separado da célula pellet por filtração através de 2 camadas de gaze estéril. Uma mucólise é realizada adicionando um volume igual de ditiotreitol 6,5 mM e a suspensão é agitada durante 20 min. Após uma centrifugação de 10 min a 550g, as células escamosas e a contagem total de células, bem como a viabilidade celular, são verificadas por exclusão de azul de tripano com um hemocitômetro manual. A contagem diferencial de leucócitos é realizada em cytospins corados com May-Grünwald-Giemsa em 500 células.

Se os critérios de qualidade (< 30% de células escamosas e viabilidade > 50%) forem respeitados, o pellet celular é misturado com 5 volumes de reagente celular RNAprotect (Qiagen, Hilden, Alemanha) e mantido a -80 °C até a extração do RNA.

No total, 50 pacientes com amostras de sobrenadante de escarro induzido com sucesso antes da terapia anti-IL-5, anti-IL5R ou anti-IgE, bem como 6 meses depois, serão analisados. Em relação às células do escarro, pacientes com amostras de boa qualidade antes e depois da terapia permitirão a análise da expressão gênica.

Imunoensaios: As concentrações dos mediadores contidos no sobrenadante do escarro são avaliadas pelo ensaio de desempenho ELISA Luminex (R and D systems, Minneapolis, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Experimentos de adição de citocinas em sobrenadantes de escarro são realizados para verificar se a recuperação está entre 80% e 120% para todos os analitos.

Métodos de extração de RNA e RT-qPCR Os níveis de proteína mediadora serão obtidos usando o kit Luminex performance XL discovery (R and D systems, Minneapolis, EUA) para IL-3 e IL-4 (limite de detecção: 0,09 pg/ml para ambos). Um kit de desempenho de alta sensibilidade Luminex será usado para IL-5, IL-13, IL-33 e GM-CSF. Os limites de detecção são 0,4, 5,1, 1,8 e 1,6 pg/ml, respectivamente.

Em relação aos níveis de expressão do gene mediador, as etapas serão realizadas exatamente como descrito recentemente. Primers e sondas serão todos obtidos da IDT (Integrated DNA Technologies, Skokie, IL, EUA). As eficiências de PCR serão calculadas usando o software de análise qbase+ qPCR (Biogazelle, Zwijnaarde, Bélgica). O mesmo programa será usado para obter a quantificação relativa na expressão gênica usando o método 2-∆∆Ct. HPRT1 e GNB2L1 serão usados ​​como genes de referência, conforme relatado anteriormente. Os pacientes serão comparados com uma coorte de 7 indivíduos saudáveis.

Essas etapas são realizadas de acordo com a descrição de da Silva et al [Clin Exp alergia 2017], exceto que a etapa Taqman PCR é realizada em placas de 96 poços e que para cada amostra, 2 µl de cDNA (diluído 1:4) é usado em um volume total de reação de 12,5 µl incluindo primer direto 500 nM, primer reverso 500 nM e sonda 250 nM para todos os genes testados. Cada qPCR é realizado em duplicado e inclui controles não modelo para cada gene. A amplificação é realizada no LightCycler 480 Real-Time PCR (Roche, Pleasanton, CA, EUA) durante 45 ciclos da seguinte forma: etapa de ativação inicial: 95 °C por 15 min; estágio de desnaturação: 94 °C por 15 s; estágio de recozimento e alongamento: 60 °C por 1 min. Os primers e as sondas são todos marcados com corantes repórter e supressor duplo 5'6-carboxifluoresceína/ZEN/3' Iowa black FQ (5'6-FAM/ZEN/3'IBFQ) e foram obtidos da IDT (Integrated DNA Technologies, Skokie , IL, EUA). As curvas padrão são geradas para cada gene usando uma diluição em série de 4 vezes de estoque de cDNA (conjunto de 4 cDNA) para verificar se todas as eficiências de PCR obtidas estão entre 1,9 e 2,1. A contaminação do DNA genômico é controlada pela realização de qPCR com cada amostra de RNA sem etapa de RT. A quantificação relativa na expressão gênica é determinada usando o software de análise qbase+ qPCR (Biogazelle, Zwijnaarde, Bélgica) usando o método 2-∆∆Ct. HPRT1 e GNB2L1 são usados ​​como genes de referência conforme previamente determinado. Todo o procedimento é feito de acordo com as diretrizes do MIQE para as informações mínimas necessárias para um experimento qPCR.

As citocinas também serão medidas no sangue de um subconjunto de pacientes.

Pontos finais do estudo

Ponto final primário:

Identificar preditores de redução das exacerbações e da dose de corticosteroides orais.

Ponto final secundário:

Para identificar preditores de melhora no ACQ (-0,5), ACT (+3pts), AQLQ (+ 0,5), eosinófilos no escarro (<3%), VEF1 (+ 200ml).

Plano Estatístico ou Análise de Dados Os resultados serão expressos como média¡SD ou média¡SEM para variáveis ​​contínuas; mediana (intervalo) para distribuições assimétricas. Para variáveis ​​categóricas, o número de observações e as porcentagens serão dadas em cada categoria. As comparações entre os diferentes subgrupos serão realizadas com um teste de Kruskal-Wallis ou teste t pareado / teste de postos sinalizados de Wilcoxon. O coeficiente de correlação de Spearman será utilizado para medir a associação entre os parâmetros clínicos.

Os cálculos de poder indicaram um tamanho de amostra total necessário de 50 indivíduos para confirmar uma mudança nos resultados.