Влияние биологических препаратов на альтернативные функции эозинофилов при тяжелой астме

Тяжелая астма наблюдается у 3–5% астматиков и характеризуется более высокой частотой обострений, плохо контролируемой астмой и/или плохой функцией легких. За последние десять лет анти-IgE и анти-IL5 (и анти-IL5R) значительно улучшили течение тяжелой астмы. Лечение хроническим или пероральным курсом кортикостероидов действительно вызывает множество побочных эффектов. Однако не хватает биомаркеров для прогнозирования ответа на анти-IL5 и анти-IgE.

Ранее мы обнаружили, что количество эозинофилов в мокроте является хорошим предиктором улучшения функции легких у пациентов с тяжелой астмой, использующих анти-ИЛ5 (Schleich et al., в печати в Clin Exp Allergy 2020). Клетки мокроты могут быть не единственным релевантным маркером мокроты для пациентов, ответивших на меполизумаб.

Цель состоит в том, чтобы оценить способность цитокинов мокроты (уровни белков и гены) (ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-13, ИЛ-33 и ГМ-КСФ) предсказывать реакцию тяжелых астматиков через 6 месяцев лечения биологическими препаратами с точки зрения снижения частоты обострений и использования кортикостероидов, улучшения ОФВ1, контроля астмы, качества жизни при астме и влияния на воспаление мокроты и крови.

Больных тяжелой астмой, наблюдаемых в Астматической клинике CHU в Льеже, очень хорошо охарактеризовали с помощью исходного измерения образцов крови, индуцированной мокроты, функции легких, FeNO, опросников контроля астмы (ACT-ACQ) и опросников качества жизни при астме (AQLQ).

Регистрируются также данные об обострениях за предыдущий год и текущем ингаляционном и пероральном лечении. Если значение ОФВ1 превышает 70% от прогнозируемого значения, больные тяжелой астмой также выполняют провокацию метахолином для оценки гиперреактивности бронхов.

Все эти мероприятия повторяют через 6 мес лечения меполизумабом. Все супернатанты мокроты хранятся при температуре -80°C, также доступна РНК из клеток мокроты.

Целевой размер выборки: 50 пациентов

Мы планируем измерять различные цитокины в мокроте (IL3, GM-CSF, IL5, IL-13, IL-33, IL-4…) и оценивать их способность прогнозировать ответ после 6 месяцев лечения различными биологическими препаратами с точки зрения снижение частоты обострений и использования кортикостероидов, улучшение ОФВ1 (+200 мл), контроля астмы (снижение ACQ > 0,5, повышение ACT > 3), качества жизни при астме (увеличение показателя AQLQ > 0,5) и влияние на мокроту и кровь воспаление.

Больных астмой набирают через поликлинику и центр легочной реабилитации (ЧУ, Сарт-Тильман, Льеж). Астму диагностируют в соответствии с рекомендациями GINA (http://ginasthma.org/).

Индукция и обработка мокроты. Мокрота индуцируется и обрабатывается, как описано ранее (Delvaux Thorax 2014). Всю мокроту собирают в пластиковый контейнер, взвешивают и гомогенизируют с тремя объемами фосфатно-солевого буфера (PBS), встряхивают в течение 30 с и центрифугируют при 800 g в течение 10 мин при 4°C. Супернатант отделяют от клеток. осадок фильтрованием через 2 слоя стерильной марли. Проводят муколиз добавлением равного объема 6,5 мМ дитиотреитола и встряхивают суспензию в течение 20 мин. После центрифугирования в течение 10 мин при 550g плоские клетки и общее количество клеток, а также жизнеспособность клеток проверяют с помощью исключения трипанового синего с помощью ручного гемоцитометра. Дифференциальный подсчет лейкоцитов проводят на цитоспинах, окрашенных по Май-Грюнвальду-Гимзе, на 500 клетках.

Если критерии качества (< 30 % плоскоклеточных клеток и жизнеспособность > 50 %) соблюдены, клеточный осадок смешивают с 5 объемами клеточного реагента RNAprotect (Qiagen, Hilden, Германия) и хранят при температуре -80 °C до выделения РНК.

Всего будет проанализировано 50 пациентов с успешно индуцированными образцами супернатантов мокроты до терапии анти-ИЛ-5, анти-ИЛ5Р или анти-IgE, а также через 6 месяцев после нее. Что касается клеток мокроты, у пациентов с образцами хорошего качества до и после терапии можно будет провести анализ экспрессии генов.

Иммуноанализы: Концентрации медиаторов, содержащихся в супернатанте мокроты, оценивают с помощью анализа производительности ELISA Luminex (R and D systems, Миннеаполис, США) в соответствии с инструкциями производителя. Эксперименты по добавлению цитокинов в супернатанты мокроты проводятся для проверки того, что восстановление составляет от 80% до 120% для всех аналитов.

Экстракция РНК и методы RT-qPCR Уровни белка-посредника будут получены с использованием набора для обнаружения Luminex Performance XL (R и D systems, Миннеаполис, США) для IL-3 и IL-4 (предел обнаружения: 0,09 пг/мл для обоих). Для IL-5, IL-13, IL-33 и GM-CSF будет использоваться высокочувствительный комплект Luminex. Пределы обнаружения составляют 0,4, 5,1, 1,8 и 1,6 пг/мл соответственно.

Что касается уровней экспрессии гена-посредника, шаги будут выполняться точно так же, как недавно описано. Все праймеры и зонды будут получены от IDT (Integrated DNA Technologies, Skokie, IL, USA). Эффективность ПЦР будет рассчитана с использованием программного обеспечения для анализа qbase+ qPCR (Biogazelle, Zwijnaarde, Бельгия). Та же программа будет использоваться для получения относительного количественного определения экспрессии генов с использованием метода 2-∆∆Ct. Как сообщалось ранее, в качестве эталонных генов будут использоваться HPRT1 и GNB2L1. Пациентов будут сравнивать с когортой из 7 здоровых людей.

Эти этапы выполняются в соответствии с описанием da Silva et al. [Clin Exp Allergy 2017], за исключением того, что этап Taqman PCR выполняется в 96-луночных планшетах и ​​для каждого образца используется 2 мкл кДНК (разбавленный 1:4). в общем реакционном объеме 12,5 мкл, включая 500 нМ прямого праймера, 500 нМ обратного праймера и 250 нМ зонда для всех тестируемых генов. Каждая qPCR реализуется в двух экземплярах и включает нематричные контроли для каждого гена. Амплификацию проводят на ПЦР в реальном времени LightCycler 480 (Roche, Плезантон, Калифорния, США) в течение 45 циклов следующим образом: начальная стадия активации: 95 °C в течение 15 мин; стадия денатурации: 94 °С в течение 15 с; стадия отжига и удлинения: 60 °С в течение 1 мин. Все праймеры и зонды помечены репортерными красителями и красителями с двойным гасителем 5'6-карбоксифлуоресцеин/ZEN/3' Iowa black FQ (5'6-FAM/ZEN/3'IBFQ) и были получены от IDT (Integrated DNA Technologies, Skokie , Иллинойс, США). Для каждого гена строят стандартные кривые с использованием 4-кратного серийного разведения исходной кДНК (пул из 4 кДНК), чтобы проверить, что все полученные эффективности ПЦР находятся в диапазоне от 1,9 до 2,1. Загрязнение геномной ДНК контролируется путем проведения количественной ПЦР с каждым образцом РНК без этапа RT. Относительное количественное определение экспрессии генов определяют с использованием программного обеспечения для анализа qPCR qbase+ (Biogazelle, Zwijnaarde, Бельгия) с использованием метода 2-∆∆Ct. HPRT1 и GNB2L1 используются в качестве эталонных генов, как определено ранее. Вся процедура выполняется в соответствии с рекомендациями MIQE для минимальной информации, необходимой для эксперимента qPCR.

Цитокины также будут измеряться в крови подгруппы пациентов.

Конечные точки исследования

Первичная конечная точка:

Выявить предикторы снижения частоты обострений и снижения дозы пероральных кортикостероидов.

Вторичная конечная точка:

Чтобы определить предикторы улучшения ACQ (-0,5), АКТ (+3 балла), AQLQ (+0,5), эозинофилы мокроты (<3%), ОФВ1 (+200мл).

Статистический план или анализ данных Результаты будут выражены как среднее SD или среднее SEM для непрерывных переменных; медиана (диапазон) для асимметричных распределений. Для категориальных переменных количество наблюдений и проценты будут указаны в каждой категории. Сравнения между различными подгруппами будут выполняться с помощью критерия Крускала-Уоллиса или парного t-критерия/критерия знакового ранга Уилкоксона. Коэффициент корреляции Спирмена будет использоваться для измерения связи между клиническими параметрами.

Расчеты мощности показали, что необходимый общий размер выборки составляет 50 субъектов, чтобы подтвердить изменение результатов.