Effet des produits biologiques sur les fonctions alternatives des éosinophiles dans l'asthme sévère

L'asthme sévère est observé chez 3 à 5 % de la population asthmatique et se caractérise par un taux plus élevé d'exacerbations, un asthme mal contrôlé et/ou une mauvaise fonction pulmonaire. Au cours des dix dernières années, les anti-IgE et anti-IL5 (et anti-IL5R) ont considérablement amélioré l'état d'asthme sévère. Le traitement par voie chronique ou orale de corticoïdes est en effet responsable de beaucoup d'effets secondaires. Il manque cependant des biomarqueurs pour la prédiction des répondeurs aux anti-IL5 et anti-IgE.

Nous avons précédemment découvert que le nombre d'éosinophiles dans les expectorations est un bon prédicteur de l'amélioration de la fonction pulmonaire des asthmatiques sévères utilisant l'anti-IL5 (Schleich et al, sous presse dans Clin Exp Allergy 2020). Les cellules d'expectoration pourraient ne pas être le seul marqueur d'expectoration pertinent pour les répondeurs au mépolizumab.

L'objectif est d'évaluer la capacité des cytokines des expectorations (taux de protéines et gènes) (IL-3, IL-4, IL-5, IL-13, IL-33 et GM-CSF) à prédire la réponse des asthmatiques sévères après 6 mois de traitement avec des agents biologiques en termes de réduction des exacerbations et de l'utilisation de corticostéroïdes, d'amélioration du VEMS, du contrôle de l'asthme, de la qualité de vie de l'asthme et de l'effet sur l'inflammation des expectorations et du sang.

Les asthmatiques sévères vus à la Clinique de l'Asthme du CHU de Liège sont très bien caractérisés à l'aide des mesures de base des échantillons sanguins, des expectorations induites, de la fonction pulmonaire, du FeNO, des questionnaires de contrôle de l'asthme (ACT - ACQ) et des questionnaires de qualité de vie de l'asthme (AQLQ).

Les données sur les exacerbations au cours de l'année précédente et les traitements inhalés et oraux actuels sont également enregistrées. Si la valeur du VEMS est supérieure à 70 % de la valeur prédite, les asthmatiques sévères effectuent également un test de provocation à la méthacholine pour évaluer l'hyperréactivité bronchique.

Toutes ces mesures sont répétées après 6 mois de traitement par mépolizumab. Tous les surnageants d'expectoration sont conservés à -80°C et l'ARN des cellules d'expectoration est également disponible.

Taille cible de l'échantillon : 50 patients

Nous prévoyons de mesurer différentes cytokines dans les crachats (IL3, GM-CSF, IL5, IL-13, IL-33, IL-4…) et d'évaluer leur capacité à prédire la réponse après 6 mois de traitement avec différents biologiques en termes de réduction des exacerbations et de l'utilisation de corticostéroïdes, amélioration du VEMS (+200 ml), du contrôle de l'asthme (diminution de l'ACQ > 0,5, augmentation de l'ACT > 3), de la qualité de vie de l'asthme (augmentation du score AQLQ > 0,5) et de l'effet sur les expectorations et le sang inflammation.

Les patients asthmatiques sont recrutés via la polyclinique et le centre de réadaptation pulmonaire (CHU, Sart-Tilman, Liège). L'asthme est diagnostiqué comme décrit dans les directives GINA (http://ginasthma.org/).

Induction et traitement des expectorations. L'expectoration est induite et traitée comme décrit précédemment (Delvaux Thorax 2014). L'ensemble des crachats est recueilli dans un récipient en plastique, pesé et homogénéisé avec trois volumes de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), vortexé pendant 30 s et centrifugé à 800 g pendant 10 min à 4 ° C. Le surnageant est séparé de la cellule culot par filtration à travers 2 couches de gaze stérile. Une mucolyse est réalisée en ajoutant un volume égal de dithiothréitol 6,5 mM et la suspension est secouée pendant 20 min. Après une centrifugation de 10 min à 550g, les numérations des cellules squameuses et des cellules totales ainsi que la viabilité cellulaire sont contrôlées par exclusion au bleu trypan avec un hémocytomètre manuel. La numération différentielle des leucocytes est réalisée sur des cytospins colorés au May-Grünwald-Giemsa sur 500 cellules.

Si les critères de qualité (< 30 % de cellules squameuses et viabilité > 50 %) sont respectés, le culot cellulaire est mélangé avec 5 volumes de réactif cellulaire RNAprotect (Qiagen, Hilden, Allemagne) et maintenu à -80 °C jusqu'à l'extraction de l'ARN.

Au total, 50 patients avec des échantillons de surnageant d'expectoration induits avec succès avant la thérapie anti-IL-5, anti-IL5R ou anti-IgE ainsi que 6 mois après seront analysés. En ce qui concerne les cellules d'expectoration, les patients avec des échantillons de bonne qualité avant et après la thérapie permettront l'analyse de l'expression génique.

Immunoessais : Les concentrations des médiateurs contenus dans le surnageant de crachat sont évaluées par ELISA Luminex performance assay (R and D systems, Minneapolis, USA) selon les instructions du fabricant. Des expériences de dopage de cytokines dans des surnageants d'expectoration sont réalisées pour vérifier que la récupération est comprise entre 80% et 120% pour tous les analytes.

Méthodes d'extraction d'ARN et de RT-qPCR Les taux de protéines médiatrices seront obtenus à l'aide du kit de découverte Luminex performance XL (R and D systems, Minneapolis, USA) pour l'IL-3 et l'IL-4 (limite de détection : 0,09 pg/ml pour les deux). Un kit de performance haute sensibilité Luminex sera utilisé pour IL-5, IL-13, IL-33 et GM-CSF. Les limites de détection sont respectivement de 0,4, 5,1, 1,8 et 1,6 pg/ml.

En ce qui concerne les niveaux d'expression des gènes médiateurs, les étapes seront effectuées exactement comme décrit récemment. Les amorces et les sondes seront toutes obtenues auprès d'IDT (Integrated DNA Technologies, Skokie, IL, USA). L'efficacité de la PCR sera calculée à l'aide du logiciel d'analyse qbase+ qPCR (Biogazelle, Zwijnaarde, Belgique). Le même programme sera utilisé pour obtenir une quantification relative de l'expression des gènes en utilisant la méthode 2-∆∆Ct. HPRT1 et GNB2L1 seront utilisés comme gènes de référence comme également rapporté précédemment. Les patients seront comparés à une cohorte de 7 sujets sains.

Ces étapes sont réalisées selon la description de da Silva et al [Clin Exp allergy 2017] sauf que l'étape de PCR Taqman est réalisée dans des plaques 96 puits et que pour chaque échantillon, 2 µl d'ADNc (dilué 1:4) sont utilisés dans un volume réactionnel total de 12,5 µl comprenant une amorce sens 500 nM, une amorce antisens 500 nM et une sonde 250 nM pour tous les gènes testés. Chaque qPCR est réalisée en double et inclut des contrôles non-modèles pour chaque gène. L'amplification est réalisée sur le LightCycler 480 Real-Time PCR (Roche, Pleasanton, CA, USA) pendant 45 cycles comme suit : étape d'activation initiale : 95 °C pendant 15 min ; étape de dénaturation : 94 °C pendant 15 s ; étape de recuit et d'allongement : 60 °C pendant 1 min. Les amorces et les sondes sont toutes marquées avec des colorants rapporteurs et double-quencher 5'6-carboxyfluorescéine/ZEN/3' Iowa black FQ (5'6-FAM/ZEN/3'IBFQ) et ont été obtenues auprès d'IDT (Integrated DNA Technologies, Skokie , Illinois, États-Unis). Des courbes standard sont générées pour chaque gène en utilisant une dilution en série de 4 fois d'ADNc stock (pool de 4 ADNc) pour vérifier que toutes les efficacités de PCR obtenues sont comprises entre 1,9 et 2,1. La contamination de l'ADN génomique est contrôlée en effectuant une qPCR avec chaque échantillon d'ARN sans étape de RT. La quantification relative de l'expression génique est déterminée à l'aide du logiciel d'analyse qbase+ qPCR (Biogazelle, Zwijnaarde, Belgique) en utilisant la méthode 2-∆∆Ct. HPRT1 et GNB2L1 sont utilisés comme gènes de référence comme déterminé précédemment. Toute la procédure est effectuée conformément aux directives MIQE pour les informations minimales requises pour une expérience qPCR.

Les cytokines seront également mesurées dans le sang d'un sous-ensemble de patients.

Critères d'évaluation de l'étude

Critère principal :

Identifier les facteurs prédictifs de réduction des exacerbations et de la dose de corticostéroïdes oraux.

Critère secondaire :

Pour identifier les prédicteurs d'amélioration de l'ACQ (-0,5), ACT (+3pts), AQLQ (+0,5), éosinophiles des crachats (<3%), FEV1 (+ 200ml).

Plan statistique ou analyse des données Les résultats seront exprimés en moyenne¡SD ou en moyenne¡SEM pour les variables continues ; médiane (gamme) pour les distributions asymétriques. Pour les variables catégorielles, le nombre d'observations et les pourcentages seront donnés dans chaque catégorie. Les comparaisons entre les différents sous-groupes seront effectuées avec un test de Kruskal-Wallis ou un test t apparié / test de rang signé de Wilcoxon. Le coefficient de corrélation de Spearman sera utilisé pour mesurer l'association entre les paramètres cliniques.

Les calculs de puissance ont indiqué une taille d'échantillon totale requise de 50 sujets pour confirmer un changement dans les résultats.