Effect van Biologicals op alternatieve functies van eosinofielen bij ernstig astma

Ernstig astma wordt waargenomen bij 3 tot 5% van de astmatische bevolking en wordt gekenmerkt door een hoger aantal exacerbaties, slecht gecontroleerde astma en/of een slechte longfunctie. Gedurende de laatste tien jaar hebben anti-IgE en anti-IL5 (en anti-IL5R) de status van ernstig astma aanzienlijk verbeterd. Behandeling met chronisch of oraal gebruik van corticosteroïden is inderdaad verantwoordelijk voor veel bijwerkingen. Er is echter een gebrek aan biomarkers voor de voorspelling van responders op anti-IL5 en anti-IgE.

We hebben eerder ontdekt dat het aantal eosinofielen in het sputum goede voorspellers zijn voor verbetering van de longfunctie van ernstige astmapatiënten die anti-IL5 gebruiken (Schleich et al, in druk in Clin Exp Allergy 2020). Sputumcellen zijn mogelijk niet de enige relevante sputummarker voor responders op mepolizumab.

Het doel is om het vermogen van sputumcytokines (eiwitniveaus en genen) (IL-3, IL-4, IL-5, IL-13, IL-33 en GM-CSF) te evalueren om de respons van ernstige astmapatiënten te voorspellen na 6 maanden behandeling met biologische geneesmiddelen in termen van vermindering van exacerbaties en gebruik van corticosteroïden, verbetering van FEV1, van astmacontrole, van de kwaliteit van leven van astma en het effect op sputum- en bloedontsteking.

Ernstige astmapatiënten die in de Astmakliniek van het CHU van Luik worden gezien, zijn zeer goed gekarakteriseerd met behulp van basismetingen van bloedmonsters, geïnduceerd sputum, longfunctie, FeNO, astmacontrolevragenlijsten (ACT - ACQ) en astmakwaliteitsvragenlijsten (AQLQ).

Gegevens over exacerbaties in het voorgaande jaar en de huidige inhalatie- en orale behandeling worden ook geregistreerd. Als de FEV1-waarde hoger is dan 70% van de voorspelde waarde, voeren ernstige astmapatiënten ook een methacholineprovocatie uit om bronchiale hyperreactiviteit te evalueren.

Al deze maatregelen worden na 6 maanden behandeling met mepolizumab herhaald. Alle sputumsupernatanten worden bewaard bij -80°C en RNA van sputumcellen is ook beschikbaar.

Beoogde steekproefomvang: 50 patiënten

We zijn van plan om verschillende cytokines in het sputum te meten (IL3, GM-CSF, IL5, IL-13, IL-33, IL-4...) en om hun vermogen te evalueren om de respons na 6 maanden behandeling met verschillende biologische geneesmiddelen te voorspellen in termen van vermindering van exacerbaties en gebruik van corticosteroïden, verbetering van FEV1 (+200 ml), van astmacontrole (ACQ-daling >0,5, ACT-toename >3), van astma-kwaliteit van leven (toename van AQLQ-score > 0,5) en het effect op sputum en bloed ontsteking.

Astmapatiënten worden gerekruteerd via de polikliniek en het longrevalidatiecentrum (CHU, Sart-Tilman, Luik). Astma wordt gediagnosticeerd zoals beschreven in de GINA-richtlijnen (http://ginasthma.org/).

Sputuminductie en -verwerking. Het sputum wordt geïnduceerd en verwerkt zoals eerder beschreven (Delvaux Thorax 2014). Het hele sputum wordt verzameld in een plastic houder, gewogen en gehomogeniseerd met drie volumes fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), gedurende 30 seconden gevortexd en gedurende 10 minuten bij 800 g bij 4°C gecentrifugeerd. Het supernatant wordt van de cel gescheiden. pellet door filtratie door 2 lagen steriel gaas. Een mucolyse wordt uitgevoerd door een gelijk volume van 6,5 mM dithiothreitol toe te voegen en de suspensie wordt gedurende 20 minuten geschud. Na een centrifugatie van 10 minuten bij 550 g worden de plaveiselcellen en het totale aantal cellen evenals de levensvatbaarheid van de cellen gecontroleerd door trypaanblauwuitsluiting met een handmatige hemocytometer. De differentiële leukocytentelling wordt uitgevoerd op cytospins gekleurd met May-Grünwald-Giemsa op 500 cellen.

Als aan de kwaliteitscriteria (< 30% plaveiselcellen en levensvatbaarheid > 50%) wordt voldaan, wordt de celpellet gemengd met 5 volumes RNAprotect-celreagens (Qiagen, Hilden, Duitsland) en bij -80 °C bewaard tot RNA-extractie.

In totaal zullen 50 patiënten met succesvolle monsters van geïnduceerd sputumsupernatant voorafgaand aan anti-IL-5-, anti-IL5R- of anti-IgE-therapie en 6 maanden daarna worden geanalyseerd. Wat de sputumcellen betreft, zullen patiënten met monsters van goede kwaliteit voor en na de therapie genexpressieanalyse mogelijk maken.

Immunoassays: De concentraties van de mediatoren in het sputumsupernatant worden bepaald door ELISA Luminex performance assay (R and D systems, Minneapolis, USA) volgens de instructies van de fabrikant. Spiking-experimenten van cytokines in sputumsupernatanten worden uitgevoerd om te controleren of het herstel voor alle analyten tussen 80% en 120% ligt.

RNA-extractie en RT-qPCR-methoden De mediator-eiwitniveaus zullen worden verkregen met behulp van de Luminex performance XL-ontdekkingskit (R en D-systemen, Minneapolis, VS) voor IL-3 en IL-4 (detectielimiet: 0,09 pg/ml voor beide). Een Luminex hooggevoelige prestatiekit zal worden gebruikt voor IL-5, IL-13, IL-33 en GM-CSF. Detectiegrenzen zijn respectievelijk 0,4, 5,1, 1,8 en 1,6 pg/ml.

Wat betreft de genexpressieniveaus van de mediator, zullen de stappen precies worden uitgevoerd zoals onlangs beschreven. Primers en probes zullen allemaal worden verkregen van IDT (Integrated DNA Technologies, Skokie, IL, VS). PCR-efficiënties zullen worden berekend met qbase+ qPCR-analysesoftware (Biogazelle, Zwijnaarde, België). Hetzelfde programma zal worden gebruikt om relatieve kwantificering in genexpressie te verkrijgen met behulp van de 2-∆∆Ct-methode. HPRT1 en GNB2L1 zullen worden gebruikt als referentiegenen, zoals ook eerder gemeld. De patiënten worden vergeleken met een cohort van 7 gezonde proefpersonen.

Deze stappen worden uitgevoerd volgens de beschrijving van da Silva et al [Clin Exp allergie 2017] behalve dat de Taqman PCR-stap wordt uitgevoerd in platen met 96 putjes en dat voor elk monster 2 µl cDNA (1:4 verdund) wordt gebruikt in een totaal reactievolume van 12,5 µl inclusief 500 nM forward primer, 500 nM reverse primer en 250 nM probe voor alle geteste genen. Elke qPCR wordt in tweevoud gerealiseerd en omvat niet-sjablooncontroles voor elk gen. Amplificatie wordt als volgt uitgevoerd op de LightCycler 480 Real-Time PCR (Roche, Pleasanton, CA, VS) gedurende 45 cycli: initiële activeringsstap: 95 °C gedurende 15 min; denaturatiefase: 94 °C gedurende 15 s; uitgloei- en rekfase: 60 °C gedurende 1 minuut. Primers en probes zijn allemaal gelabeld met reporter- en double-quencher-kleurstoffen 5'6-carboxyfluoresceïne/ZEN/3' Iowa black FQ (5'6-FAM/ZEN/3'IBFQ) en werden verkregen van IDT (Integrated DNA Technologies, Skokie , IL, VS). Voor elk gen worden standaardkrommen gegenereerd met behulp van een 4-voudige seriële verdunning van voorraad-cDNA (pool van 4 cDNA) om te controleren of alle verkregen PCR-efficiënties tussen 1,9 en 2,1 liggen. Genomische DNA-besmetting wordt gecontroleerd door qPCR uit te voeren met elk RNA-monster zonder RT-stap. Relatieve kwantificering in genexpressie wordt bepaald met behulp van qbase+ qPCR-analysesoftware (Biogazelle, Zwijnaarde, België) met behulp van de 2-∆∆Ct-methode. HPRT1 en GNB2L1 worden gebruikt als referentiegenen zoals eerder bepaald. Alle procedures worden uitgevoerd volgens de MIQE-richtlijnen voor de minimale informatie die vereist is voor een qPCR-experiment.

Cytokines zullen ook worden gemeten in het bloed van een subgroep van patiënten.

Eindpunten bestuderen

Primair eindpunt:

Om voorspellers te identificeren van vermindering van exacerbaties en van orale dosis corticosteroïden.

Secundair eindpunt:

Om voorspellers van verbetering in ACQ (-0,5) te identificeren, ACT (+3 punten), AQLQ (+ 0,5), sputum-eosinofielen (<3%), FEV1 (+ 200 ml).

Statistisch plan of gegevensanalyse De resultaten worden uitgedrukt als gemiddelde¡SD of gemiddelde¡SEM voor continue variabelen; mediaan (bereik) voor scheve verdelingen. Voor categorische variabelen wordt per categorie het aantal waarnemingen en percentages gegeven. Vergelijkingen tussen verschillende subgroepen zullen worden uitgevoerd met een Kruskal-Wallis-test of gepaarde t-test / Wilcoxon ondertekende rangtest. De Spearman-correlatiecoëfficiënt zal worden gebruikt om de associatie tussen klinische parameters te meten.

Vermogensberekeningen wezen op een vereiste totale steekproefomvang van 50 proefpersonen om een ​​verandering in uitkomsten te bevestigen.