生物制剂对严重哮喘患者嗜酸性粒细胞替代功能的影响

在 3% 至 5% 的哮喘人群中观察到重度哮喘，其特征是恶化率较高、哮喘控制不佳和/或肺功能不佳。 在过去的十年中，抗 IgE 和抗 IL5（以及抗 IL5R）显着改善了严重哮喘的状况。 长期或口服皮质类固醇治疗确实会导致很多副作用。 然而，缺乏用于预测抗 IL5 和抗 IgE 反应者的生物标志物。

我们之前发现，痰嗜酸性粒细胞计数是使用抗 IL5 改善严重哮喘患者肺功能的良好预测指标（Schleich 等人，正在出版 Clin Exp Allergy 2020）。 痰细胞可能不是美泊利单抗应答者唯一相关的痰标记物。

目的是评估痰细胞因子（蛋白质水平和基因）（IL-3、IL-4、IL-5、IL-13、IL-33 和 GM-CSF）预测严重哮喘患者 6 年后反应的能力几个月的生物制剂治疗在减少急性加重和皮质类固醇的使用、改善 FEV1、哮喘控制、哮喘生活质量以及对痰液和血液炎症的影响方面。

使用血样、诱导痰、肺功能、FeNO、哮喘控制问卷 (ACT - ACQ) 和哮喘生活质量问卷 (AQLQ) 的基线测量，可以很好地表征列日 CHU 哮喘门诊的严重哮喘患者。

还记录了前一年的恶化数据以及当前的吸入和口服治疗。 如果 FEV1 值高于预测值的 70%，严重的哮喘患者也会进行乙酰甲胆碱挑战以评估支气管高反应性。

在美泊利单抗治疗 6 个月后重复所有这些措施。 所有痰液上清液都保存在-80°C 下，也可提供来自痰液细胞的 RNA。

目标样本量：50 名患者

我们计划测量痰液中的不同细胞因子（IL3、GM-CSF、IL5、IL-13、IL-33、IL-4……），并评估它们预测不同生物制剂治疗 6 个月后反应的能力减少急性加重和皮质类固醇的使用，改善 FEV1 (+200ml)，改善哮喘控制（ACQ 降低 >0.5，ACT 升高 >3），改善哮喘生活质量（AQLQ 评分升高 > 0.5）以及对痰液和血液的影响炎。

通过门诊和肺康复中心（CHU，Sart-Tilman，Liege）招募哮喘患者。 按照 GINA 指南 (http://ginasthma.org/) 中的描述诊断哮喘。

痰的诱导和处理。 如前所述（Delvaux Thorax 2014）诱导和处理痰液。 将整个痰收集在塑料容器中，称重，并用三倍体积的磷酸盐缓冲盐水（PBS）匀浆，涡旋30秒，并在4℃下以800g离心10分钟。上清液与细胞分离通过 2 层无菌纱布过滤沉淀。 通过添加等体积的 6.5 mM 二硫苏糖醇进行粘液溶解，并在 20 分钟内摇动悬浮液。 以 550g 离心 10 分钟后，使用手动血细胞计数器通过台盼蓝排斥检查鳞状细胞和总细胞计数以及细胞活力。 在用 May-Grünwald-Giemsa 染色的细胞离心涂片上对 500 个细胞进行白细胞分类计数。

如果符合质量标准（< 30% 的鳞状细胞和存活率 > 50%），则将细胞沉淀与 5 体积的 RNAprotect 细胞试剂（Qiagen，Hilden，Germany）混合并保存在 -80 °C 直至 RNA 提取。

总共有 50 名在抗 IL-5、抗 IL5R 或抗 IgE 治疗前以及治疗后 6 个月成功诱导痰上清液样本的患者将被分析。 关于痰细胞，治疗前后具有高质量样本的患者将允许进行基因表达分析。

免疫测定：根据制造商的说明，通过 ELISA Luminex 性能测定（R 和 D 系统，美国明尼阿波利斯）评估痰上清液中介质的浓度。 对痰上清液中的细胞因子进行加标实验，以检查所有分析物的回收率是否在 80% 和 120% 之间。

RNA 提取和 RT-qPCR 方法将使用 Luminex performance XL 发现试剂盒（R and D systems，Minneapolis，USA）获得 IL-3 和 IL-4（检测限：两者均为 0.09 pg/ml）的介体蛋白水平。 Luminex 高灵敏度性能试剂盒将用于 IL-5、IL-13、IL-33 和 GM-CSF。 检测限分别为 0.4、5.1、1.8 和 1.6 pg/ml。

关于调解员基因表达水平，这些步骤将完全按照最近描述的那样执行。 引物和探针都将从 IDT (Integrated DNA Technologies, Skokie, IL, USA) 获得。 将使用 qbase+ qPCR 分析软件（Biogazelle，Zwijnaarde，比利时）计算 PCR 效率。 相同的程序将用于使用 2-ΔΔCt 方法获得基因表达的相对定量。 HPRT1 和 GNB2L1 将用作参考基因，如前所述。 这些患者将与一组 7 名健康受试者进行比较。

这些步骤是根据 da Silva 等人 [Clin Exp allergy 2017] 的描述进行的，除了 Taqman PCR 步骤是在 96 孔板中进行的，并且每个样本使用 2 µl cDNA（1:4 稀释）在 12.5 µl 的总反应体积中，包括用于所有测试基因的 500 nM 正向引物、500 nM 反向引物和 250 nM 探针。 每个 qPCR 都是一式两份实现的，并且包括每个基因的非模板控制。 在 LightCycler 480 实时 PCR（Roche，Pleasanton，CA，USA）上进行如下 45 个循环的扩增：初始激活步骤：95°C 15 分钟；变性阶段：94 °C 15 s；退火和延伸阶段：60 °C 1 分钟。 引物和探针均标有报告基因和双猝灭剂染料 5'6-羧基荧光素/ZEN/3' Iowa black FQ (5'6-FAM/ZEN/3'IBFQ)，获自 IDT（Integrated DNA Technologies, Skokie ，伊利诺伊州，美国）。 使用 4 倍连续稀释的原液 cDNA（4 个 cDNA 池）为每个基因生成标准曲线，以检查获得的所有 PCR 效率是否在 1.9 和 2.1 之间。 通过在没有 RT 步骤的情况下对每个 RNA 样本执行 qPCR 来控制基因组 DNA 污染。 使用 qbase+ qPCR 分析软件（Biogazelle，Zwijnaarde，比利时）使用 2-ΔΔCt 方法确定基因表达的相对定量。 HPRT1 和 GNB2L1 用作先前确定的参考基因。 所有程序都是根据 MIQE 指南完成的，以获得 qPCR 实验所需的最少信息。

还将在一部分患者的血液中测量细胞因子。

研究终点

主要终点：

确定急性加重和口服皮质类固醇剂量减少的预测因子。

次要终点：

确定 ACQ 改善的预测因子 (-0.5)， ACT (+3pts)、AQLQ (+ 0.5)、痰嗜酸性粒细胞 (<3%)、FEV1 (+ 200ml)。

Statistical Plan or Data analysis 对于连续变量，结果将表示为平均值·SD 或平均值·SEM；偏态分布的中值（范围）。 对于分类变量，将在每个类别中给出观察次数和百分比。 不同亚组之间的比较将使用 Kruskal-Wallis 检验或配对 t 检验/Wilcoxon 符号秩检验进行。 Spearman 相关系数将用于衡量临床参数之间的关联。

功效计算表明需要 50 名受试者的总样本量才能确认结果的变化。