생체 외 영양막 및 태반 모델 내에서 토네이트 바이러스(TONV) 및 지카 바이러스(ZIKV)에 의한 바이러스 복제 평가 (ZITOPEx)

태반은 만삭에 정상적인 단태 임신을 한 여성을 위해 정보 노트를 전달하여 구두 및 서면 정보를 제공한 후 제왕절개로 분만 후 채취합니다.

유사하게, 영양막은 자발적인 임신 종료와 관련하여 자궁 내 흡인 후에 수집됩니다.

• 세포주 및 바이러스
• 인간 태반 배양 체외이식편의 감염
• qRT-PCR에 의한 조직의 바이러스 부하 측정

태반 조직은 분만 후 1시간 이내에 처리됩니다. 융모막 융모를 5mm 절편으로 절개하고 조직을 표준 배양 배지(10% heat-inactivated fetal calf serum(FCS), 1% L-글루타민 및 1% 페니실린이 보충된 RPMI-1640)로 최소 3회 충분히 세척합니다. /스트렙토마이신)을 사용하여 모체 혈액, 세포막 및 혈전을 제거합니다.

콜라겐 겔 스펀지를 3mL의 배양 배지(15% 열 불활성화 태아 소 혈청(FCS), 1% 페니실린/스트렙토마이신, 0.1% 겐타마이신, 1% 암포테리신 B로 보충된 RPMI-1640)를 포함하는 6-웰 플레이트 웰에 배치합니다. , 1% L-글루타민, 1% 비필수 아미노산, 1% 피루브산나트륨). Chorionic villi는 5mm 섹션으로 해부되고 배양 배지와 공기 사이의 인터페이스에서 콜라겐 젤 스폰지 위에 놓입니다.

조직은 용해 완충액 + 4% TCEP(Tris(2-카르복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드)(Machery-Nagel ref: 740395.107)에서 기계적 파괴에 의해 용해됩니다. Precellys 시스템과 함께. 용해된 조직은 100 mg/mL의 Macherey-Nagel 용해 완충액으로 희석하고 분주하여 추출할 때까지 -80°C에서 보관합니다. 총 RNA는 Nucleospin 96 RNA Core 키트(Macherey Nagel ref: 740466.4)를 사용하여 이중으로 추출됩니다. 공급업체의 지침을 따릅니다.

표준 샘플, 컨트롤 및 ZIKV 및 TONV 바이러스 RNA는 동일한 조건에서 병렬로 추출 및 테스트됩니다. 추출된 RNA는 제조업체의 권장 사항에 따라 Superscript One-Step RT-qPCR 키트(Invitrogen ref: 11732088)를 사용하여 ZIKV 및 TONV에 특이적인 프로브 및 프라이머와 함께 역전사 효소에 적용됩니다.