Évaluation de la réplication virale par le virus tonique (TONV) et le virus Zika (ZIKV), dans un modèle trophoblastique et placentaire ex vivo (ZITOPEx)

Les placentas seront prélevés à la suite d'un accouchement par césarienne après information orale et écrite par la remise de la note d'information destinée aux femmes ayant eu une grossesse unique normale à terme.

De même, des trophoblastes sont prélevés suite à une aspiration endo-utérine dans le cadre d'une interruption volontaire de grossesse.

• Lignée cellulaire et virus
• Infection d'explants de culture placentaire humaine
• Détermination de la charge virale dans les tissus par qRT-PCR

Les tissus placentaires seront manipulés dans l'heure suivant l'accouchement. Les villosités choriales seront disséquées en sections de 5 mm et les tissus lavés abondamment, au minimum 3 fois avec un milieu de culture standard (RPMI-1640 additionné de 10 % de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur (FCS), 1 % de L-glutamine et 1 % de pénicilline /Streptomycine) pour éliminer le sang maternel, les membranes et les caillots sanguins.

Les éponges de gel de collagène seront placées dans des puits de plaques à 6 puits contenant 3 ml de milieu de culture (RPMI-1640 additionné de 15 % de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur (FCS), 1 % de pénicilline/streptomycine, 0,1 % de gentamycine, 1 % d'amphotéricine B , 1% L-Glutamine, 1% acide aminé non essentiel, 1% pyruvate de sodium) par puits. Les villosités choriales seront disséquées en sections de 5 mm et placées sur des éponges de gel de collagène à l'interface entre le milieu de culture et l'air.

Les tissus seront lysés par disruption mécanique dans un tampon de lyse + 4%TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride) (Machery-Nagel ref : 740395.107) avec le système Precellys. Les tissus lysés seront dilués dans 100 mg/mL de tampon de lyse Macherey-Nagel, aliquotés et stockés à -80°C jusqu'à l'extraction. L'ARN total sera extrait en double à l'aide du kit Nucleospin 96 RNA Core (Macherey Nagel ref : 740466.4), suivant les instructions du fournisseur.

Des échantillons standards, des contrôles et des ARN viraux ZIKV et TONV seront extraits et testés en parallèle dans les mêmes conditions. L'ARN extrait sera soumis à une transcriptase inverse, à l'aide du kit Superscript One-Step RT-qPCR (Invitrogen ref : 11732088) selon les recommandations du fabricant, avec une sonde et une amorce spécifiques du ZIKV et du TONV.