Evaluering af viral replikation af Tonate Virus (TONV) og Zika Virus (ZIKV), inden for en ex Vivo trofoblast og placental model (ZITOPEx)

Moderkagen indsamles efter en fødsel ved kejsersnit efter mundtlig og skriftlig information ved levering af informationssedlen til kvinder, der har haft en normal singleton-graviditet ved termin.

Tilsvarende opsamles trofoblaster efter endo-uterin aspiration i forbindelse med frivillig afbrydelse af graviditeten.

• Cellelinje og virus
• Infektion af humane placentakultureksplantater
• Bestemmelse af viral belastning i væv ved qRT-PCR

Placentavæv vil blive håndteret inden for en time efter levering. De chorioniske villi vil blive dissekeret i 5 mm sektioner, og vævene vaskes rigeligt, minimum 3 gange med et standarddyrkningsmedium (RPMI-1640 suppleret med 10 % varmeinaktiveret føtalt kalveserum (FCS), 1 % L-glutamin og 1 % penicillin /Streptomycin) for at fjerne moderens blod, membraner og blodpropper.

Kollagengelsvampe placeres i pladebrønde med 6 brønde indeholdende 3 ml dyrkningsmedium (RPMI-1640 suppleret med 15 % varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FCS), 1 % Penicillin/streptomycin, 0 1 % Gentamycin, 1 % Amphotericin B , 1% L-Glutamin, 1% ikke-essentiel aminosyre, 1% natriumpyruvat) pr. brønd. Chorionic villi vil blive dissekeret i 5 mm sektioner og placeret oven på kollagen gel svampe ved grænsefladen mellem dyrkningsmedium og luft.

Vævene vil blive lyseret ved mekanisk afbrydelse i en lyseringsbuffer + 4% TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphinhydrochlorid) (Machery-Nagel ref: 740395.107) med Precellys-systemet. De lyserede væv vil blive fortyndet i 100 mg/ml Macherey-Nagel lysisbuffer, fordelt i portioner og opbevaret ved -80°C indtil ekstraktion. Total RNA vil blive ekstraheret i duplikat ved hjælp af Nucleospin 96 RNA Core kit (Macherey Nagel ref: 740466.4), efter leverandørens anvisninger.

Standardprøver, kontroller og ZIKV og TONV viralt RNA vil blive ekstraheret og testet parallelt under de samme betingelser. Det ekstraherede RNA vil blive udsat for revers transkriptase ved hjælp af Superscript One-Step RT-qPCR-kittet (Invitrogen ref: 11732088) i henhold til producentens anbefalinger med en probe og primer, der er specifik for ZIKV og TONV.