Avaliação da replicação viral pelo vírus Tonate (TONV) e vírus Zika (ZIKV), dentro de um trofoblasto ex vivo e modelo placentário (ZITOPEx)

As placentas serão coletadas após um parto por cesariana após informações orais e escritas por meio da entrega da nota informativa para mulheres que tiveram uma gravidez única normal a termo.

Da mesma forma, os trofoblastos são coletados após a aspiração endo-uterina no contexto da interrupção voluntária da gravidez.

• Linha celular e vírus
• Infecção de explantes de cultura de placenta humana
• Determinação da carga viral em tecidos por qRT-PCR

Os tecidos placentários serão manuseados dentro de uma hora após o parto. As vilosidades coriônicas serão dissecadas em seções de 5mm e os tecidos lavados abundantemente, no mínimo 3 vezes, com meio de cultura padrão (RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino inativado pelo calor (FCS), 1% de L-Glutamina e 1% de Penicilina /estreptomicina) para remover sangue materno, membranas e coágulos sanguíneos.

As esponjas de gel de colágeno serão colocadas em poços de placa de 6 poços contendo 3mL de meio de cultura (RPMI-1640 suplementado com 15% de soro fetal bovino inativado pelo calor (FCS), 1% Penicilina/estreptomicina, 0 1% Gentamicina, 1% Anfotericina B , 1% L-Glutamina, 1% aminoácido não essencial, 1% piruvato de sódio) por poço. As vilosidades coriônicas serão dissecadas em seções de 5mm e colocadas sobre esponjas de gel de colágeno na interface entre o meio de cultura e o ar.

Os tecidos serão lisados ​​por ruptura mecânica em tampão de lise + 4%TCEP (cloridrato de tris(2-carboxietil)fosfina) (Machery-Nagel ref: 740395.107) com o sistema Precellys. Os tecidos lisados ​​serão diluídos em 100 mg/mL de tampão de lise Macherey-Nagel, aliquotados e armazenados a -80°C até a extração. O RNA total será extraído em duplicata usando o kit Nucleospin 96 RNA Core (Macherey Nagel ref: 740466.4), seguindo as instruções do fornecedor.

Amostras padrão, controles e RNA viral do ZIKV e TONV serão extraídos e testados em paralelo nas mesmas condições. O RNA extraído será submetido à transcriptase reversa, utilizando o kit Superscript One-Step RT-qPCR (Invitrogen ref: 11732088) de acordo com as recomendações do fabricante, com sonda e primer específicos para ZIKV e TONV.