Evaluación de la replicación viral por virus Tonate (TONV) y virus Zika (ZIKV), dentro de un modelo de trofoblasto y placenta ex vivo (ZITOPEx)

Las placentas se recogerán tras un parto por cesárea previa información oral y escrita mediante entrega de la nota informativa para mujeres que hayan tenido un embarazo único normal a término.

De manera similar, los trofoblastos se recolectan después de la aspiración endouterina en el contexto de la interrupción voluntaria del embarazo.

• Línea celular y virus
• Infección de explantes de cultivo de placenta humana
• Determinación de carga viral en tejidos por qRT-PCR

Los tejidos de la placenta se manipularán dentro de la hora posterior al parto. Las vellosidades coriónicas se diseccionarán en secciones de 5 mm y los tejidos se lavarán abundantemente, mínimo 3 veces con un medio de cultivo estándar (RPMI-1640 suplementado con suero fetal bovino (FCS) termoinactivado al 10 %, L-Glutamina al 1 % y Penicilina al 1 %. /estreptomicina) para eliminar la sangre materna, las membranas y los coágulos de sangre.

Las esponjas de gel de colágeno se colocarán en placas de 6 pocillos que contienen 3 ml de medio de cultivo (RPMI-1640 suplementado con 15 % de suero fetal bovino (FCS) inactivado por calor, 1 % de penicilina/estreptomicina, 0 1 % de gentamicina, 1 % de anfotericina B , 1 % de L-glutamina, 1 % de aminoácidos no esenciales, 1 % de piruvato de sodio) por pocillo. Las vellosidades coriónicas se diseccionarán en secciones de 5 mm y se colocarán sobre esponjas de gel de colágeno en la interfaz entre el medio de cultivo y el aire.

Los tejidos se lisarán mediante rotura mecánica en un tampón de lisis + TCEP al 4 % (clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina) (Machery-Nagel ref: 740395.107) con el sistema Precellys. Los tejidos lisados ​​se diluirán en 100 mg/ml de tampón de lisis Macherey-Nagel, se dividirán en alícuotas y se almacenarán a -80 °C hasta la extracción. El ARN total se extraerá por duplicado utilizando el kit Nucleospin 96 RNA Core (Macherey Nagel ref: 740466.4), siguiendo las instrucciones del proveedor.

Las muestras estándar, los controles y el ARN viral de ZIKV y TONV se extraerán y analizarán en paralelo en las mismas condiciones. El ARN extraído se someterá a transcriptasa inversa, utilizando el kit Superscript One-Step RT-qPCR (Invitrogen ref: 11732088) según las recomendaciones del fabricante, con una sonda y un cebador específicos para ZIKV y TONV.