Valutazione della replicazione virale da parte del virus tonato (TONV) e del virus Zika (ZIKV), all'interno di un modello di trofoblasto e placentare ex vivo (ZITOPEx)

Le placente verranno prelevate a seguito di parto con taglio cesareo previa informazione orale e scritta mediante consegna della nota informativa per le donne che hanno avuto una normale gravidanza singola a termine.

Allo stesso modo, i trofoblasti vengono raccolti a seguito di aspirazione endouterina nel contesto dell'interruzione volontaria della gravidanza.

• Linea cellulare e virus
• Infezione di espianti di colture placentari umane
• Determinazione della carica virale nei tessuti mediante qRT-PCR

I tessuti placentari verranno manipolati entro un'ora dal parto. I villi coriali saranno sezionati in sezioni di 5 mm e i tessuti lavati abbondantemente, minimo 3 volte con un terreno di coltura standard (RPMI-1640 integrato con 10% siero di vitello fetale inattivato al calore (FCS), 1% L-glutammina e 1% penicillina /streptomicina) per rimuovere il sangue materno, le membrane e i coaguli di sangue.

Le spugne di gel di collagene verranno poste in pozzetti a 6 pozzetti contenenti 3 ml di terreno di coltura (RPMI-1640 integrato con 15% siero bovino fetale inattivato al calore (FCS), 1% penicillina/streptomicina, 0,1% gentamicina, 1% amfotericina B , 1% L-glutammina, 1% amminoacido non essenziale, 1% piruvato di sodio) per pozzetto. I villi coriali saranno sezionati in sezioni di 5 mm e posti sopra spugne di gel di collagene all'interfaccia tra terreno di coltura e aria.

I tessuti saranno lisati mediante rottura meccanica in un tampone di lisi + 4% TCEP (Tris(2-carbossietil)fosfina cloridrato) (Machery-Nagel ref: 740395.107) con il sistema Precellys. I tessuti lisati saranno diluiti in 100 mg/mL di Macherey-Nagel lysis buffer, aliquotati e conservati a -80°C fino all'estrazione. L'RNA totale sarà estratto in duplicato utilizzando il kit Nucleospin 96 RNA Core (Macherey Nagel ref: 740466.4), seguendo le indicazioni del fornitore.

Campioni standard, controlli e RNA virale di ZIKV e TONV saranno estratti e testati in parallelo nelle stesse condizioni. L'RNA estratto sarà sottoposto a trascrittasi inversa, utilizzando il kit Superscript One-Step RT-qPCR (Invitrogen ref: 11732088) secondo le raccomandazioni del produttore, con una sonda e un primer specifici per ZIKV e TONV.