Ocena replikacji wirusa przez wirusa Tonate (TONV) i wirusa Zika (ZIKV), w modelu trofoblastu i łożyska ex vivo (ZITOPEx)

Łożyska będą pobierane po porodzie przez cesarskie cięcie po uprzednim poinformowaniu ustnym i pisemnym poprzez doręczenie noty informacyjnej dla kobiet, które w terminie miały ciąże pojedynczą prawidłowa.

Podobnie trofoblasty są pobierane po aspiracji endometrium w kontekście dobrowolnego przerwania ciąży.

• Linia komórkowa i wirus
• Zakażenie eksplantatów ludzkich kultur łożyskowych
• Oznaczanie wiremii w tkankach metodą qRT-PCR

Tkanki łożyska będą przetwarzane w ciągu jednej godziny od porodu. Kosmki kosmówkowe zostaną pocięte na skrawki 5 mm, a tkanki obficie przemyte, co najmniej 3 razy standardową pożywką hodowlaną (RPMI-1640 uzupełnioną 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą cielęcą (FCS), 1% L-glutaminą i 1% penicyliną /streptomycyna) w celu usunięcia matczynej krwi, błon i skrzepów krwi.

Kolagenowe gąbki żelowe zostaną umieszczone w 6-studzienkowych płytkach zawierających 3 ml pożywki hodowlanej (RPMI-1640 z dodatkiem 15% inaktywowanej termicznie bydlęcej surowicy płodowej (FCS), 1% penicyliny/streptomycyny, 0,1% gentamycyny, 1% amfoterycyny B , 1% L-glutaminy, 1% nieistotnych aminokwasów, 1% pirogronianu sodu) na studzienkę. Kosmki kosmówkowe zostaną pocięte na skrawki o grubości 5 mm i umieszczone na wierzchu gąbek z żelem kolagenowym na granicy pożywki hodowlanej i powietrza.

Tkanki zostaną poddane lizie przez mechaniczne rozerwanie w buforze do lizy + 4% TCEP (chlorowodorek tris(2-karboksyetylo)fosfiny) (Machery-Nagel ref: 740395.107) z systemem Precellys. Zlizowane tkanki zostaną rozcieńczone w 100 mg/ml buforu do lizy Macherey-Nagel, podzielone na porcje i przechowywane w -80°C do czasu ekstrakcji. Całkowity RNA zostanie wyekstrahowany w dwóch powtórzeniach przy użyciu zestawu Nucleospin 96 RNA Core (Macherey Nagel ref: 740466.4), zgodnie z instrukcjami dostawcy.

Standardowe próbki, kontrole oraz wirusowe RNA ZIKV i TONV będą ekstrahowane i testowane równolegle w tych samych warunkach. Wyekstrahowany RNA zostanie poddany odwrotnej transkryptazie przy użyciu zestawu Superscript One-Step RT-qPCR (nr ref. Invitrogen: 11732088) zgodnie z zaleceniami producenta, z sondą i starterem specyficznym dla ZIKV i TONV.