Flawonoidy, ćwiczenia, fenole pochodzące z jelit

Projekt badania: Uczestnicy badania (N=85) zostaną włączeni do badania i losowo przydzieleni do grup otrzymujących suplementy flawonoidów lub placebo na 2 tygodnie, przy czym te dwie niezależne grupy będą prowadzone równolegle (przy przewidywanym pomyślnym ukończeniu wszystkich faz badania przez N=80) . Suplementy będą podawane metodą podwójnie ślepej próby w postaci kapsułek. Uczestnicy badania zgłoszą się do ośrodka badawczego w celu przeprowadzenia testów wyjściowych i orientacji, a następnie przed badaniem i po 2-tygodniowej suplementacji, a następnie ponownie 24 godziny później. Pobrane zostaną cztery próbki krwi, jak pokazano na rysunku (przed i po suplementacji, po wysiłku/odpoczynku i 24 godziny po wysiłku/odpoczynku). Zgłaszając się do laboratorium po 2-tygodniowej suplementacji, uczestnicy badania zostaną losowo przydzieleni do siedzenia lub energicznego chodzenia na bieżniach przez 45 minut. Grupa porównawcza 20 biegaczy przyjmujących suplement flawonoidów i biegających przez 2,5 godziny w laboratorium zostanie uwzględniona, aby umożliwić porównanie umiarkowanego i intensywnego wysiłku (i dostarczyć danych pilotażowych do przyszłych badań). Test wyjściowy: Jeden do dwóch tygodni przed rozpoczęciem badania uczestnicy badania (spacerowicze i biegacze) zostaną zapoznani z badaniem, a następnie wyrażą dobrowolną zgodę. Zostaną podane instrukcje dotyczące rejestrowania całego spożycia żywności i napojów w 3-dniowych dziennikach żywności (czwartek, piątek i sobota przed rozpoczęciem suplementacji). Historie demograficzne i szkoleniowe zostaną pozyskane za pomocą kwestionariuszy. Zostanie zmierzony wzrost, masa ciała i procent tkanki tłuszczowej (skala impedancji bioelektrycznej seca Medical Body Composition Analyzer 514, Hanover, MD). VO2max będzie oceniane przy użyciu protokołu bieżni Bruce'a, przy ciągłym monitorowaniu zużycia tlenu i wentylacji za pomocą systemu metabolicznego Cosmed CPET.

Wizyta w laboratorium przed suplementacją: pierwszego dnia badania uczestnicy (spacerowicze i biegacze) powrócą do laboratorium na czczo (9 lub więcej godzin bez jedzenia i picia poza wodą). Próbki krwi będą pobierane z żyły łokciowej u osób w pozycji siedzącej. Uczestnicy (spacerowicze) otrzymają 2-tygodniowy zapas kapsułek flawonoidów lub placebo, ułożonych w tacach z suplementami, aby ułatwić przestrzeganie zaleceń. Biegacze otrzymają 2-tygodniowy zapas kapsułek z flawonoidami. Zespół badawczy przejrzy i zgromadzi zapis żywności z 3 dni, a następnie przeanalizuje zawartość składników odżywczych i flawonoidów za pomocą Food Processor v. 11.1 (ESHA Research, Salem, Oregon). Każda żywność/napój zostanie oceniona pod kątem makro- i mikroskładników odżywczych, całkowitych i częściowych flawonoidów dla każdej z sześciu podklas flawonoidów oraz dwóch indywidualnych wartości flawonoidów (kwercetyna, EGCG). W okresie 2 dni przed wizytą nr 3 w laboratorium oraz przez cały dzień obejmujący wizytę nr 3 uczestnicy będą proszeni o unikanie jedzenia i napojów zawierających sukralozę (Splenda) i mannitol. Aby uniknąć sukralozy i mannitolu, uczestnicy zostaną poproszeni o sprawdzenie listy składników dietetycznych napojów gazowanych, jogurtów i innych produktów mlecznych, przekąsek, gumy do żucia i cukierków, produktów o niskiej zawartości cukru, pasty do zębów i płynów do płukania ust.

Wizyty laboratoryjne po suplementacji:

Po 2-tygodniowym okresie suplementacji uczestnicy (spacerowicze i biegacze) powrócą do laboratorium na czczo (tego samego dnia tygodnia, co wizyta w laboratorium przed suplementacją).

Uczestnicy odwrócą tacę z suplementami, aby zweryfikować przestrzeganie przyjmowania kapsułek. Zostanie pobrana próbka krwi. Uczestnicy (spacerowicze) zostaną losowo przydzieleni do tego, aby albo siedzieć przez 45 minut w laboratorium, albo chodzić energicznie przez 45 minut na bieżni o stopniowanej intensywności 5% przy 60% VO2max (z monitorowaniem metabolizmu przez pierwsze 5 minut, a następnie o 15, 30, i 45 minut) przy użyciu wózka metabolicznego Cosmed CPET. Biegacze będą biegać przy 70% VO2max na niesklasyfikowanej bieżni przez 2,5 godziny, z pomiarami metabolizmu wykonywanymi co 30 minut. Woda zostanie podana ad libitum dla wszystkich uczestników, bez innych napojów i jedzenia. Tuż przed sesją laboratoryjną w pozycji siedzącej lub marszowej oraz 2,5-godzinnym biegiem uczestnicy spożyją 150 ml roztworu zawierającego 1 g sacharozy, 1 g laktulozy, 0,5 g L-ramnozy, 1 g erytrytolu, 1 g sukralozy, 0,5 g mannitolu .

Mocz będzie zbierany do plastikowych pojemników przez 24h w dwóch oddzielnych frakcjach: 0-5h i 5-24h. Podczas pierwszej 5-godzinnej zbiórki moczu nie wolno jeść ani pić (z wyjątkiem wody z kranu). Uczestnicy wrócą następnego ranka na czczo, pobiorą próbkę krwi i zwrócą próbki moczu.

Wytyczne dotyczące pobierania moczu dla osób badanych:

• Należy zbierać każdą kroplę moczu w każdym okresie zbiórki (5 godzin od rozpoczęcia wysiłku, a następnie druga zbiórka trwająca do następnego ranka lub od 5 do 24 godzin od rozpoczęcia ćwiczeń). Nie ma znaczenia, ile lub mało moczu oddaje się za każdym razem, o ile zbiera się każdą kroplę.
• Zbierz każdą kroplę moczu w ciągu dnia i nocy do dwóch butelek do pobierania (0-5 godzin, 5-24 godzin, począwszy od rozpoczęcia sesji testu wysiłkowego). Butelki przechowuj w lodówce. Pamiętaj, aby zebrać mocz oddany podczas wypróżnień.
• Zakończ, zbierając pierwszy mocz oddany następnego ranka i dodając go do butelki zbiorczej. Zabierz ze sobą obie butelki do pobierania moczu do laboratorium (tj. rano po sesji ćwiczeń, kiedy oddasz ostatnią próbkę krwi).

Suplement flawonoidowy: kapsułki suplementu i placebo zostaną przygotowane przez Reoxcyn Innovation Group LLC (Salt Lake City, UT). (ZOBACZ informacje o uzupełnieniu w załączonym pliku). Składniki będą takie same, jak testowane w próbie społeczności: witamina C (jako palmitynian askorbylu) (Green Wave Ingredients, La Mirada, CA), ekstrakt z owoców dzikiej borówki (25% wszystkich antocyjanów) (FutureCeuticals, Momence, IL), zielona herbata ekstrakt z liści (50% EGCG) (Watson Industries, Inc., Pomona, CA), aglikon kwercetyny (Novel Ingredients, East Hanover, NJ), kofeina (Creative Compounds, Scott City, MO) i kwasy tłuszczowe omega 3 (Novotech Nutraceuticals , Ventura, Kalifornia). Składniki i substancje pomocnicze wypełnienia kapsułki to Nu-Flow 70R (z łusek ryżowych), tapioka z korzenia manioku, naturalna krzemionka z bambusa, korzeń prawoślazu. Kapsułki placebo będą zawierać tylko składniki wypełniające i substancje pomocnicze (bez składników aktywnych). Dzienna porcja dla spacerowiczów to 2 kapsułki flawonoidów lub 2 kapsułki placebo. Dwie kapsułki flawonoidów dostarczają 329 mg flawonoidów (średnia dla dorosłych Amerykanów, w zależności od badania, wynosi 240 mg dziennie). Dzienna porcja dla biegaczy to 4 kapsułki flawonoidów (658 mg flawonoidów). Uczestnicy otrzymają 2-tygodniowy zapas kapsułek z flawonoidem lub placebo, wraz z instrukcją, jak spożywać codziennie w podzielonych dawkach (1 ze śniadaniem i 1 z obiadem lub podwoić tę ilość dla biegaczy). Uczestnicy badania będą mogli dodać jedną dodatkową kapsułkę dziennie w celu zwiększenia spożycia, jeśli pominą jeden lub dwa dni przyjmowania suplementu. Uczestnicy badania przyjmą 2 kapsułki (4 dla biegaczy) tuż po oddaniu próbki krwi podczas sesji laboratoryjnej marszu/odpoczynku (lub biegu).

KAPSUŁKI SUPLEMENTOWE zostaną TESTOWANE pod kątem zawartości flawonoidów przed i po badaniu przeprowadzonym przez dr Mary Ann Lila (NCSU, Plants for Human Health Institute, NCRC).

Ukierunkowana analiza metaboliczna:

Pochodzące z jelit fenolowe metabolity zostaną oczyszczone z osocza metodą SPE przy użyciu zautomatyzowanej platformy i wewnętrznego protokołu SPE z 96 dołkami (60 mg, 3 ml; Phenomenex) w celu ekstrakcji 100 μl tkanki. Wszystkie anality zostały wcześniej zoptymalizowane pod kątem wydajności ekstrakcji między 80-100% odzysku przy CV≤10%. Ekstrakty zostaną rozdzielone i oznaczone ilościowo za pomocą chromatografii cieczowej tandem-MS/MS z wykorzystaniem wcześniej opublikowanych i zatwierdzonych metodologii. W skrócie, analiza HPLC-ESI-MS/MS zostanie przeprowadzona przy użyciu SCIEX UPLC sprzężonego 6500 + MS/MS-QTRAP™ wyposażonego w źródło jonizacji przez elektrorozpylanie (ESI) Turbo-V (krew i metabolity kału), z próbkami wstrzykniętymi na Kolumna Kinetex PFP i gradient fazy ruchomej składały się z 0,1% kwasu mrówkowego (obj./obj.) w wodzie (A) i 0,1% kwasu mrówkowego (obj./obj.) w acetonitrylu (B) i 24 min czasu rozdzielania. Protokół analizy docelowych metabolitów został zoptymalizowany i zweryfikowany w celu wykrycia ponad 200 analitów, które są oznaczane ilościowo w stosunku do autentycznych komercyjnych i syntetycznych standardów w naszej bibliotece, z domniemanymi koniugatami fazy II zidentyfikowanymi za pomocą profilowania fragmentacji obejmującego 3-5 unikalnych przejść. Obejmuje to skanowanie ponad 1000 przejść odpowiadających koniugatom siarczanu, glukuronidu, metylu i glicyny. Ta metodologia SMRM została wcześniej zoptymalizowana pod kątem leczenia preparatem Rexocyn i zapewnia znacznie bardziej czułą metodę niż tradycyjne procedury skanowania z monitorowaniem wielu reakcji (MRM), ponieważ umożliwia monitorowanie większej liczby przejść w jednostce czasu, a ponadto pozwala na unikalne, zależne od związku parametrów, które należy wykorzystać dla każdego analitu, co skutkuje zwiększoną czułością. Wreszcie, metabolity zostaną potwierdzone na podstawie czasu retencji (w miarę możliwości przy użyciu autentycznych i zsyntetyzowanych standardów) oraz trzech lub więcej przejść jonowych z prekursora do produktu. Siedmiopunktowe dopasowane do matrycy krzywe kalibracyjne w zakresie od 0 do 10 μM zostaną wykorzystane do analizy flawonoidów lub od 0 do 50 μM do analizy metabolitów fenolowych.

Przepuszczalność jelitowa, mocz Laktuloza/Rhamnoza:

Stężenia cukru w ​​moczu zostaną określone za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej. Sacharoza w 0-5-godzinnym moczu, stosunek laktuloza/ramnoza (L/R) w 0-5-godzinnym moczu i stosunek sukraloza/erytrytol (S/E) w 5-24-godzinnym moczu zostaną użyte jako wskaźniki dla żołądka i dwunastnicy odpowiednio przepuszczalność jelita cienkiego i grubego.