Różnicowa ekspresja SERCA w mięśniach krtani

Zwierzęta w tym badaniu, dorosłe szczury Wistar (Shimizu Laboratory Supplies Co., Kioto, Japonia), w wieku 8-12 tygodni, ważące 280-350 g (n = 10) zastosowano jako młode szczury. Ponadto 24-miesięczne szczury (n = 10) zastosowano jako modele starzejące się.

Zwierzęta przygotowujące do tkanki zwierząt znieczulono dootrzewnowym wstrzyknięciem pentobarbitalu sodu (dawka 30-60 mg/kg) i utrwalono 4% paraformaldehydem po perfuzji sercowej 0,01 m soli soli buforowanej fosforanem (PBS). Krtowe krtani zostały natychmiast wycięte i zanurzono w tym samym utrwalaniu przez około 12 godzin w (4 ° C). Tkanki przetwarzano w parafinie i podzielono na mikrotom (grubość 8-10 μm).

Badane wewnętrzne mięśnie krtani to: 1) przyśrodkowe i boczne tarczycy (MTA, LTA), (2) boczne cricoarytenoid (LCA), (3) doskonały kricoarytenoid (SCA), (4) tylny kricoarytenoid (PCA) i (5) i (5) i (5) i (5) Cricothyroid (CT).

Immunohistochemia (IHC) Śledczy napotykali nieudaną identyfikację typu szybkiego włókien na zamrożonych sekcjach, a następnie przeszliśmy na sekcje parafinowe. Skrawki deparafinizowane inkubowano z 3% H2O2 w PBS przez 10 minut, a następnie obróbkę mikrofalową (5 minut × 3 razy przy 500 watach w buforze cytrynianowym, pH 6). Następnie skrawki inkubowano w roztworze blokującym (0,3 m glicyny, 50 mM chlorku amonu i 1% BSA w PBS) przez 30 minut przed inkubacją w pierwotnych przeciwciałach. Skrawki inkubowano z przeciwciałami anty-SERCA1 lub -SERCA2 i anty-MHC I lub -MHCII (Tabela 1) przez 1-2 dni w 4 ° ® 594 Osioł anty-goat IgG wtórny ABS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Podwójne IHC przeprowadzono przy użyciu kombinacji (anty-SERCA1 + ANTERCA2) i (anty-SERCA2 + ANT-MHCII) w celu sprawdzenia koekspresji. W podwójnym IHC te same kroki wykonano z mieszaniną pierwotnych lub wtórnych przeciwciał z tymi samymi rozcieńczeniami.

Immunologiczne skrawki tkanki zbadano za pomocą laserowego mikroskopu konfokalnego FV-1000 (Olympus, Tokio, Japonia). Oprogramowanie ImageJ 1.46 wykorzystano do ręcznego zliczania i obliczenia odsetka komórek dodatnich dla każdego przeciwciała.

Immunohistochemia dla odżywionego szczura W 8-12 tygodniach, starzejące się szczury, krtani podeszto przez nacięcie linii środkowej przy użyciu standardowego mikroskopu operacyjnego w znieczuleniu z pentobarbitalem sodu. Po zidentyfikowaniu prawych nawracających i wyższych nerwów krtani, odcinek 1 cm usunięto z prawego nawracającego nerwu krtaniowego i oba końce zatniono. Podzielono również odpowiedni nerw krtaniowy. Odżywione grupy szczurów poświęcono po 2, 4, 8 i 12 tygodniach. Larynx zebrano i przygotowano do IHC przy użyciu tej samej procedury opisanej powyżej (n = 5 w każdej grupie).

Podtypy MHC przy użyciu wielokolorowego pisania światłowodowego:

Na początku naszych badań wypróbowaliśmy zamrożoną sekcję. Po próbach kilku technik zmniejszania autofluorescencji i szumu w tle badacze nie mieli dobrego barwienia. Następnie śledczy zaprzestali podtypowania MHC i przesunęli się na analizę statystyczną bloków zatopionych w parafinie Względny skład SERCA i MHC dla każdego mięśnia. Dostępne dane dotyczące dodatniego odsetka komórek każdego przeciwciała szczura analizowano statystycznie przy użyciu oprogramowania statystycznego SPSS, wersja 16. Porównania statystyczne przeprowadzono przy użyciu niesparowanego dwustronnego testu t-Studenta i zostały uznane za znaczące przy p <0,05.

Wykonano jednokierunkową analizę wariancji (ANOVA), a następnie test post hoc Scheffe w celu porównania składu MHC i SERCA dla każdego mięśnia w odżywianiu się ze stroną przeciwną i młodą z wiekiem. Przedstawione wartości to średnie ± SD (odchylenie standardowe), przy czym SD jest między szczurami.