Espressione differenziale Serca nei muscoli laringei

Animali in questo studio, i ratti Wistar adulti maschi (Shimizu Laboratory Supplies Co., Kyoto, Giappone), 8-12 settimane di età, pesando 280-350 g (n = 10) sono stati usati come giovani ratti. Inoltre, i ratti di 24 mesi (n = 10) sono stati impiegati come modelli invecchiati.

Gli animali da preparazione del tessuto animale sono stati anestetizzati con un'iniezione intraperitoneale di sodio pentobarbital (dose 30-60 mg/kg) e sono stati fissati con paraformaldeide al 4% a seguito di perfusione cardiaca con salina tamponata con fosfato 0,01 m (PBS). I tegole sono stati asportati immediatamente e immersi nello stesso fissativo per circa 12 ore a (4 ° C). I tessuti sono stati elaborati in paraffina e sezionati usando un microtomo (spessore di 8-10 μm).

I muscoli laringei intrinseci studiati erano: 1) tiroarientoide mediale e laterale (MTA, LTA), (2) Cricoarytenoid laterale (LCA), (3) Cricoarytenoid superio Cricicotiroide (CT).

Immunoistochimica (IHC) Gli investigatori hanno affrontato un'identificazione del tipo di fibra veloce senza successo su sezioni congelate, quindi ci siamo spostati sulle sezioni di paraffina. Le sezioni deparaffinizzate sono state incubate con H2O2 al 3% in PBS per 10 minuti seguiti da un trattamento a microonde (5 minuti × 3 volte a 500 watt in tampone citrato, pH 6). Quindi, le sezioni sono state incubate in una soluzione di blocco (glicina 0,3 M, cloruro di ammonio 50 mM e 1% di BSA in PBS) per 30 minuti prima dell'incubazione negli anticorpi primari. Le sezioni sono state incubate con anticorpi anti-Serca1 o -serca2 e anti-MHC I o -MHCII (Tabella 1) per 1-2 giorni a 4 ° C, quindi lavati e incubati con Alexa Fluor® 488 Anti-topo IgG e Fluor ® 594 ABS ANTI-capro IgG ANTICO ANTICO per 1 ora a temperatura ambiente. Il doppio IHC è stato eseguito utilizzando combinazioni (anti-Serca1 + anti-Serca2) e (anti-Serca2 + anti-MHCII) per verificare la co-espressione. In doppio IHC, gli stessi passaggi sono stati fatti con una miscela di anticorpi primari o secondari con le stesse diluizioni.

Le sezioni di tessuto immunocolorate sono state esaminate utilizzando un microscopio confocale laser FV-1000 (Olympus, Tokyo, Giappone). Il software ImageJ 1.46 è stato utilizzato per contare e calcolare manualmente la percentuale di cellule positive per ciascun anticorpo.

Immunoistochimica per il ratto denervato in 8-12 settimane, ratti anziani, la laringe è stata avvicinata attraverso un'incisione della linea mediana usando un microscopio operativo standard in anestesia con sodio pentobarbital. Dopo l'identificazione dei nervi laringei ricorrenti e superiori di destra, è stato rimosso un segmento di 1 cm dal nervo laringeo ricorrente a destra ed entrambe le estremità sono state legate. Anche il nervo laringeo superiore destro era diviso. I gruppi di ratto denervati sono stati sacrificati dopo 2, 4, 8 e 12 settimane. La laringe è stata raccolta e preparata per IHC usando la stessa procedura sopra descritta (n = 5 in ciascun gruppo).

Sottotipi MHC che utilizzano digitazione in fibra multicolore:

All'inizio della nostra ricerca, abbiamo provato la sezione congelata. Dopo le prove di diverse tecniche per ridurre l'autofluorescenza e il rumore di fondo, gli investigatori non hanno avuto una buona colorazione. Quindi, gli investigatori hanno interrotto il sottotizzazione di MHC e si sono spostati su blocchi incorporati in paraffina Analisi statistica La composizione relativa SERCA e MHC per ciascun muscolo è stata calcolata. I dati disponibili per la percentuale cellulare positiva di ciascun anticorpo di ratto sono stati analizzati statisticamente utilizzando il software statistico SPSS, versione 16. I confronti statistici sono stati eseguiti utilizzando il test t di Student a due code non accoppiato e sono stati considerati significativi a p <0,05.

L'analisi a senso unico della varianza (ANOVA) seguita dal test post hoc di Scheffe è stata eseguita per confrontare la composizione MHC e SERCA per ciascun muscolo in denervazione con il lato controlaterale e i giovani con età. I valori presentati sono mezzi ± DS (deviazione standard), con SD attraverso i ratti.