Szybka diagnostyka infekcji stawu protetycznego za pomocą desorpcji laserowej wspomaganej matrycą

Materiał i metody

1. Pacjenci, u których istnieje wysokie prawdopodobieństwo zakażenia w oparciu o kryteria Towarzystwa Zakażeń Mięśniowo-Szkieletowych (MSIS), u których zaplanowano tylko oczyszczenie lub oczyszczenie z usunięciem implantu, zostaną zaproszeni do udziału w badaniu po podpisaniu świadomej zgody.

   Płyn maziowy zostanie pobrany przed wykonaniem artrotomii na sali operacyjnej. Aspiraty będą pobierane przy zastosowaniu techniki aseptycznej sterylną strzykawką 18-Fr o minimalnej objętości 14 cm3. Próbka zostanie podzielona na spektrometrię mas MALDI-TOF w standardowych butelkach do posiewów krwi (10 cm3), probówkę do hodowli ran (2 cm3) i analizę płynu maziowego (2 cm3). Próbki zostaną dostarczone do laboratorium mikrobiologicznego w ciągu 2 godzin.

2. Hodowla bakterii i identyfikacja konwencjonalna Identyfikacja bakterii zostanie przeprowadzona metodą konwencjonalną z wykorzystaniem systemu Vitek 2. W przypadku hodowli konwencjonalnej, 1 µl dobrze wymieszanego mazi stawowej zostanie zaszczepiony i rozprowadzony na płytkach z agarem z krwią i płytkach z agarem MacConkeya przy użyciu sterylnej plastikowej jednorazowej ezy. Płytki będą inkubowane w atmosferze tlenowej w temperaturze 37°C przez 18-24 godz. Po zaobserwowaniu wzrostu bakterii kolonie na agarze z krwią zostaną zliczone, a kolonie z obu typów płytek zostaną zidentyfikowane za pomocą systemu Vitek 2.

3. Identyfikacja MALDI-TOF MS Zawiesina otrzymana w wyniku powyższego przygotowania próbki będzie wirowana przy 13 000 g przez 2 minuty, a supernatant zostanie odrzucony. Osad będzie wirowany przy 13 000 g przez kolejne 2 minuty przed usunięciem pozostałego etanolu. Do osadu dodaje się pięćdziesiąt mikrolitrów kwasu mrówkowego (70% v/v) i 50 ml 100% acetonitrylu i dokładnie miesza po dodaniu każdego odczynnika. Zawiesinę ponownie wiruje się przy 13 000 g przez kolejne 2 minuty, a 1 ml supernatantu nanosi się na stalową płytkę docelową. Analiza zostanie przeprowadzona po wysuszeniu na powietrzu 1 ml roztworu matrycowego kwasu α-cyjano-4-hydroksycynamonowego umieszczonego na wysuszonej próbce w dwóch powtórzeniach.

   Profile widm masowych zostaną pozyskane przy użyciu spektrometru masowego microflex LT MALDI-TOF (Bruker Daltonics, Bremen, Niemcy) zgodnie z ustawieniami producenta. Widma będą rejestrowane w trybie liniowym dodatnim przy częstotliwości lasera 60 Hz w zakresie mas od 2000 Da do 20 000 Da. Wszystkie identyfikacje bakterii zostaną przeprowadzone przez MALDI-TOF Biotyper RTC oraz oprogramowanie i bibliotekę Bruker MALDI Biotyper 3.1 (4613 izolatów; Bruker Daltonics). Kryteria stosowane do analizy i identyfikacji mikroorganizmów będą zgodne z zaleceniami producenta.

4. Analiza statystyczna Czas do identyfikacji zostanie określony jako czas od powstania kolonii do momentu zgłoszenia ostatecznego wyniku lekarzowi. Przeprowadzona zostanie analiza statystyczna w celu porównania trzech metod przy użyciu testów chi-kwadrat. Poziom istotności statystycznej zostanie ustalony na poziomie p < 0,05.