Rychlá diagnostika protetické kloubní infekce pomocí matrice asistované laserové desorpce

Materiály a metody

1. Pacienti, u kterých je vysoká pravděpodobnost infekce na základě kritérií Musculoskeletal Infection Society (MSIS) a je u nich naplánován pouze debridement nebo debridement s odstraněním implantátu, budou pozváni k zařazení do studie po podepsaném informovaném souhlasu.

   Synoviální kloubní tekutina bude odebrána před artrotomií na operačním sále. Aspiráty budou odebírány za aseptické techniky pomocí 18-Fr sterilní stříkačky s minimálním množstvím 14 ccs. Vzorek bude rozdělen mezi MALDI-TOF hmotnostní spektrometrii ve standardních lahvích pro hemokultury (10 ccs), kultivační zkumavky na rány (2 ccs) a analýzu synoviální tekutiny (2 ccs). Vzorky budou doručeny do mikrobiologické laboratoře do 2 hodin.

2. Bakteriální kultivace a konvenční identifikace Bakteriální identifikace bude provedena konvenční metodou pomocí systému Vitek 2. Pro konvenční kultivaci se naočkuje 1 µl dobře promíchané synoviální kloubní tekutiny a rozprostře se na plotny s krevním agarem a plotny s MacConkey agarem pomocí sterilní plastové kličky na jedno použití. Destičky budou inkubovány v aerobní atmosféře při 37 °C po dobu 18-24 hodin. Když je pozorován bakteriální růst, budou spočítány kolonie na krevním agaru a kolonie z obou typů misek budou identifikovány pomocí systému Vitek 2.

3. Identifikace MALDI-TOF MS Suspenze získaná po výše uvedené přípravě vzorku bude centrifugována při 13 000 g po dobu 2 minut a supernatant bude odstraněn. Peleta bude centrifugována při 13 000 g další 2 minuty před odstraněním zbytkového ethanolu. Do pelety se přidá 50 mikrolitrů kyseliny mravenčí (70% v/v) a 50 ml 100% acetonitrilu a po přidání každého činidla se důkladně promíchá. Suspenze se znovu centrifuguje při 13 000 g po dobu dalších 2 minut a 1 ml supernatantu se nanese na ocelovou cílovou destičku. Analýza bude provedena po vysušení vzduchem 1 ml matricového roztoku kyseliny a-kyano-4-hydroxyskořicové umístěného na vysušenou skvrnu vzorku v duplikátech.

   Profily hmotnostních spekter budou získány pomocí hmotnostního spektrometru microflex LT MALDI-TOF (Bruker Daltonics, Brémy, Německo) podle nastavení výrobce. Spektra budou zaznamenávána v lineárním pozitivním módu při laserové frekvenci 60 Hz v hmotnostním rozsahu od 2000 Da do 20 000 Da. Všechny identifikace bakterií budou prováděny pomocí MALDI-TOF Biotyper RTC a softwaru a knihovny Bruker MALDI Biotyper 3.1 (4613 izolátů; Bruker Daltonics). Kritéria použitá pro analýzu a identifikaci mikroorganismů budou podle doporučení výrobce.

4. Statistická analýza Doba do identifikace bude určena jako doba od vytvoření kolonie do doby, kdy je konečný výsledek oznámen lékaři. Pro srovnání těchto tří metod bude provedena statistická analýza pomocí Chí-kvadrát testů. Hladina statistické významnosti bude nastavena na p < 0,05.