Wpływ celowo wystawionej bariery PTFE-d na środowisko policzkowe w sterowanej regeneracji kości w celu zachowania wyrostka

Projekt badania To kliniczno-laboratoryjne, równoległe, randomizowane, prospektywne i kontrolowane badanie będzie miało na celu określenie wpływu bariery PTFE-d celowo wystawionej na działanie środowiska policzkowego na sterowaną regenerację kości w celu zachowania wyrostka zębodołowego, z wykorzystaniem mikrobiologicznych, radiograficznych, zorientowanych na pacjenta wyników, molekularnych wzór markerów związanych z kością i stabilizacja implantu.

Grupy eksperymentalne

Po znieczuleniu miejscowym wykonano nacięcie śródmiąższowe wokół zęba przeznaczonego do ekstrakcji i oddzielono płat śluzówkowo-okostnowy w celu odpowiedniego odsłonięcia 3 mm grzebienia zębodołowego przylegającego do zębodołu. Następnie przeprowadzono zabiegi zwichnięcia i usunięcia zębów w sposób małoinwazyjny, z użyciem okostomów, dźwigni i ekstraktorów w razie potrzeby. Następnie przeprowadzono irygację roztworem soli fizjologicznej, a następnie za pomocą specjalnego oprogramowania pacjenci zostaną losowo przydzieleni do jednego z następujących zabiegów:

Grupa GBR: Po ekstrakcji membrana PTFE-d (CytoplastTM Ti-250 Titanium-Reinforced, Anterior Narrow 12 mm x 24 mm, Osteogenics, Lubbock, TX, USA) została dostosowana za pomocą nożyczek i dopasowana nad zębodołem, przekraczając trzy milimetry od jego marginesy. Następnie membranę wprowadzono podokostnowo pod płatami policzkowymi i podniebiennymi za pomocą odłączacza Molta. Wykonano minimalne odbicie płatka, aby ustabilizować membranę, która była celowo wystawiona na działanie środowiska jamy ustnej. Przed założeniem szwów potwierdzono bierną stabilność błony nad zębodołem oraz brak fałd i zmarszczek błony. Następnie zbliżono płatki w pozycji przedekstrakcyjnej i zszyto szwami krzyżowymi, mającymi na celu zwiększenie stabilności błony, nicią PTFE 4-0 (Cytoplast PTFE, CS0618PREM, Osteogenics, Lubbock, TX, USA).

Grupa Non-GBR: Po ekstrakcji nie przeprowadzono dalszego leczenia. Następnie płaty zostały ponownie umieszczone i zszyte nicią nylonową 5.0 (Ethicon, Jonhson's Jonhson, São José dos Campos).

Tymczasowe protezy adhezyjne dopasowane do sąsiednich zębów zostały założone i utrzymane do momentu wszczepienia implantu. Kontrolę biofilmu naddziąsłowego wykonano płynami do płukania jamy ustnej z 0,12% chlorheksydyną przez okres 4 tygodni we wszystkich grupach doświadczalnych. Wskazano przedoperacyjne leczenie przeciwzapalne (deksametazon 4 mg, pojedyncza dawka, 1 godzinę przed zabiegiem) oraz pooperacyjne leki przeciwbólowe (dipiron sodu 500 mg, co 4 godziny, przez 3 dni). Pacjentów poinstruowano, aby przyjmowali leki przeciwbólowe tylko w przypadku bólu w okresie opisanym powyżej, poinstruowano ich, aby odnotowywali ilość przyjętych leków. Profilaktyczną antybiotykoterapię ogólnoustrojową przeprowadzono na 1 godzinę przed zabiegami chirurgicznymi 2 gramami amoksycyliny i ten sam lek będzie przepisywany przez 7 dni w okresie pooperacyjnym, 500 mg co 8 godzin.

Szwy usunięto po 15 dniach. W grupie GBR błonę usunięto po 28 dniach, w znieczuleniu (Hoffmann i wsp. 2007, Carbonell i wsp. 2014, Cheon i wsp. 2017), usuwając delikatnie ruchem trakcyjnym za pomocą pinceta.

Wszyscy pacjenci byli monitorowani co miesiąc, przez cały okres badania, w celu obserwacji pielęgnacji przyzębia i wzmocnienia instrukcji higienicznych.

Wszczepianie implantów i protez Trzy miesiące po ekstrakcji, niezależnie od grupy eksperymentalnej, pacjenci otrzymywali implanty zębowe. W związku z tym zostały one uformowane z myślą o planowaniu rehabilitacji, a szablony chirurgiczne zostały wykonane do wykorzystania w chirurgii wszczepienia implantów. W zabiegu chirurgicznym pacjentów poddano znieczuleniu miejscowemu i wykonano płaty śluzówkowo-okostnowe w celu uzyskania dostępu i odpowiedniego odsłonięcia kości wyrostka zębodołowego. Następnie wykonano wiercenie w celu wprowadzenia implantów. W obu grupach wykonano jednoetapowe wszczepienie implantów z natychmiastowym osadzeniem protez tymczasowych na implantach. Wszystkie operacje wykonywał ten sam operator (EKM).

Po fazie eksperymentalnej badań zainstalowano ostateczne protezy. Szwy po zabiegach chirurgicznych wykonano nićmi nylonowymi 5.0 (Ethicon, Jonhson's Jonhson, São José dos Campos) i usunięto je po 7 dniach. Kontrolę biofilmu naddziąsłowego wykonano płynami do płukania jamy ustnej z 0,12% chlorheksydyną przez okres 7 dni po zabiegu. Wskazane było przedoperacyjne leczenie przeciwzapalne (deksametazon 4 mg, pojedyncza dawka, 1 godzina przed zabiegiem) oraz pooperacyjne leki przeciwbólowe (dipiron sodu 500 mg, co 4 godziny, przez 2 dni).

Badanie kliniczne Ten sam egzaminator (SB) wykonywał wszystkie pomiary kliniczne. Do przeprowadzenia kalibracji wewnątrz egzaminatora wybrano 15 osób nie biorących udziału w badaniu z implantami dentystycznymi. Badacz zmierzył głębokość sondowania wokół implantu u wszystkich osób dwukrotnie w ciągu 24 godzin. Korelację wewnątrzklasową obliczono jako powtarzalność 95%.

Za pomocą sondy North Carolina/Colorvue (Hu-Friedy, Chicago, IL, USA) zmierzono następujące parametry w czterech miejscach implantów dentystycznych włączonych do badania na początku badania (przed ekstrakcją i GBR) oraz po 3 miesiącach obserwacji: góra: Głębokość sondowania (PPD/mm), która była odległością od dna bruzdy/kieszonki przyzębnej do brzegu ozębnej; Clinical Attachment Level (CAL/mm), czyli odległość od połączenia szkliwa cementowego do dna kieszonki przyzębnej.

Ocena mikrobiomu Ocenę mikrobiologiczną biofilmu obecnego na barierach (grupa GBR) oraz w miejscu naprawy (grupa spoza GBR) wykonano po 3 dniach ekstrakcji i po 28 dniach (w momencie usunięcia bariery w grupie GBR) ).

Analiza mikrobiologiczna zostanie przeprowadzona techniką sekwencjonowania genu 16S przez platformę Illumina HiSeq, która pozwala określić różnorodność i liczebność populacji drobnoustrojów w tej samej próbce. Ocena ta zostanie przeprowadzona w Scentralizowanym Multi-User Laboratory of Functional Genomics.

Ocena parametrów zgłaszanych przez pacjenta Ocena parametrów skoncentrowanych na pacjencie dotyczących objawów związanych z chorobowością i jakością życia w okresie pooperacyjnym zostanie przeprowadzona po 3, 7, 14, 28, 35 i 42 dniach od ekstrakcji z wykorzystaniem kwestionariuszy , w oparciu o linię poziomą o długości 100 mm (wizualna skala analogowa; VAS).

Molekularna ocena markerów związanych z osteoklastami / blastogenezą W chirurgicznym zabiegu osadzania implantów dentystycznych, podczas frezowania w celu przygotowania łoża, zostanie usunięta tkanka kostna za pomocą jednorazowego kolektora kostnego przystosowanego do pompy próżniowej/aspiratora chirurgicznego. Część próbki tkanki kostnej zostanie wykorzystana do analizy ekspresji genów, a część do analizy immunoenzymatycznej różnych biomarkerów związanych z osteoklastami / blastogenezą. Wszystkie analizy molekularne związane z markerami osteoklastów / blastogenezy będą wykonywane w Stomatologicznym Laboratorium Badawczym Centrali Zakładu. Wszystkie zebrane biopsje będą przechowywane w specjalnym roztworze, aby uniknąć degradacji RNA (RNAlater®, Ambion Inc., Austin, TX).

Analiza ekspresji genów Ekstrakcja RNA: Usunięte tkanki zostaną odpowiednio zapakowane w roztworze, aby uniknąć degradacji RNA (RNAlater®, Ambion Inc., Austin, TX). Całkowity RNA zostanie wyizolowany metodą odczynników TRIZOL (Gibco BRL, Life Technologies, Rockville, MD, USA). Najpierw odessany zostanie roztwór RNAlater, a następnie rozdrobniona próbka zostanie umieszczona w odczynniku TRIZOL, wytrząsana przez 30 sekund i inkubowana przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Po tym czasie zostanie dodany chloroform (Sigma, St. Louis, MO, USA), wymieszany i odwirowany z prędkością 10 000 obrotów na minutę przez 15 minut w temperaturze 4oC. Część wodną przenosi się do innej probówki, do której dodaje się izopropanol, wstrząsa, inkubuje przez 20 minut w temperaturze -20oC i odwirowuje w sposób opisany powyżej. Po tym procesie powstanie peletka, którą przemywa się schłodzonym 75% etanolem i suszy w temperaturze pokojowej. Próbki RNA zostaną ponownie zawieszone w około 50 µl wody potraktowanej pirowęglanem dietylu (DEPC) i przechowywane w temperaturze -70oC. Stężenie RNA zostanie określone za pomocą spektrofotometru.

Przeprowadzona zostanie obróbka DNAazą oraz PCR w czasie rzeczywistym (RT-PCR). Startery dla GAPDH (gen referencyjny), Transformującego czynnika wzrostu (TGF-β), Sialoproteiny kostnej (BSP) i Kolagenu typu I (COL-I) ) zostaną zaprojektowane za pomocą pGBRram opracowanego specjalnie do projektowania starterów dla LightCycler (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Niemcy). Wszystkie startery zostaną sprawdzone pod kątem specyficzności poprzez sprawdzenie krzywej topnienia przy użyciu kontroli dodatnich i ujemnych. Profil reakcji zostanie określony zgodnie ze wzorem sugerowanym przez producenta sprzętu. W każdym z „przebiegów” woda będzie używana jako kontrola negatywna, a produkt reakcji będzie oznaczany ilościowo przy użyciu pGBRram producenta (LightCycler Relative Quantification Software – Roche Diagnostics GmbH). GAPDH zostanie użyty jako gen odniesienia (porządkowanie) do normalizacji wartości.

Analiza immunoenzymatyczna Część próbki tkanki kostnej pobranej podczas umieszczania implantu zostanie umieszczona w sterylnych probówkach zawierających 400 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) z 0,05% Tween-20. Wszystkie próbki będą przechowywane w temperaturze -20°C. Następnie tkanka zostanie zważona, zhomogenizowana i rozpuszczona w PBS do końcowego stężenia 100 mg tkanki/ml. Po mieszaniu na Vortexie przez 10 minut, każdą próbkę wiruje się przy 370 g przez 5 minut, zbiera się supernatant i przechowuje w temperaturze -70°C do czasu użycia. Aby uniknąć aktywności proteazy, cała procedura zostanie przeprowadzona w temperaturze 4°C. Dickkopf (DKK1), Sklerostyna (SOST), Czynnik martwicy nowotworów (TNF-α), Osteoprotegeryna (OPG), Osteokalcyna (OC), Osteopontyna (OPN) ( HBNMAG-51K, Millipore Corporation, Billerica, MA, USA), NF-κB wiążący receptor aktywatora (RANKL) (HRNKLMAG-31K-01, Millipore Corporation, Billerica, MA, USA), osteonektyna (OSN) i kwaśna fosfataza oporna na winian ( TRAP) (HCMBMAG-22K, Millipore Corporation, Billerica, MA, USA), zostanie określony przy użyciu technologii Luminex / MAGpix, która pozwala na określenie obecności i ilościowe określenie w sposób bezwzględny stężenia różnych markerów w tej samej próbce.

W tym celu analizy zostaną przeprowadzone na płytkach 96-dołkowych, przy pomocy wspomnianych wyżej paneli o wysokiej czułości, zgodnie z zaleceniami producenta. Próbki zostaną ocenione w dwóch powtórzeniach, a średnia uzyskanych wartości zostanie wykorzystana do obliczyć stężenia każdego markera.

Analiza tomograficzna Tomografia komputerowa pacjentów zostanie wykonana bezpośrednio po ekstrakcji i 3 miesiące później (przed wszczepieniem implantu). Badania tomograficzne wykonane w różnych okresach będą analizowane pod kątem tempa utraty kości po ekstrakcji i zachowaniu zębodołu, zarówno w pionie, jak iw poziomie, za pomocą oprogramowania Dental Slice.