Impacto da barreira de PTFE-d exposta intencionalmente ao ambiente bucal na regeneração óssea guiada para preservação do rebordo

Desenho do estudo Este estudo clínico-laboratorial, paralelo, randomizado, prospectivo e controlado determinará o impacto da barreira de PTFE-d intencionalmente exposta ao ambiente bucal na regeneração óssea guiada para preservação do rebordo, usando resultados microbiológicos, radiográficos, centrados no paciente, molecular padrão de marcadores relacionados ao osso e estabilização do implante.

Grupos experimentais

Após anestesia local, uma incisão intrasulcular foi feita ao redor do dente a ser extraído e um retalho mucoperiosteal foi descolado para exposição adequada de 3 mm da crista alveolar adjacente ao alvéolo. Após, foram realizados procedimentos de deslocamento e remoção dentária de forma minimamente invasiva, utilizando-se periótomos, alavancas e extratores, se necessário. Posteriormente, foi realizada irrigação com solução salina e, em seguida, por meio de software específico, os pacientes serão randomizados para receber um dos seguintes tratamentos:

Grupo GBR: Após a extração, a membrana de PTFE-d (CytoplastTM Ti-250 Titanium-Reinforced, Anterior Narrow 12 mm x 24 mm, Osteogenics, Lubbock, TX, EUA) foi customizada com tesoura e ajustada sobre o alvéolo, ultrapassando três milímetros de suas margens. Em seguida, a membrana foi inserida subperiostalmente sob os retalhos vestibular e palatino com o auxílio do descolador Molt. Reflexão mínima do retalho foi realizada para estabilizar a membrana, que foi mantida intencionalmente exposta ao meio bucal. Antes da sutura, foi confirmada a estabilidade passiva da membrana sobre o alvéolo, bem como a ausência de dobras ou rugas na membrana. Os retalhos foram então abordados na posição pré-extração e suturados com pontos cruzados, visando aumentar a estabilidade da membrana, com fio PTFE 4-0 (Cytoplast PTFE, CS0618PREM, Osteogenics, Lubbock, TX, EUA).

Grupo não-GBR: Após a extração, nenhum tratamento adicional foi realizado. Os retalhos foram então reposicionados e suturados com fio de náilon 5.0 (Ethicon, Jonhson's Jonhson, São José dos Campos).

Próteses adesivas temporárias adaptadas aos dentes adjacentes foram instaladas e mantidas até o momento da colocação do implante. O controle do biofilme supragengival foi realizado com bochechos de clorexidina 0,12% por um período de 4 semanas em todos os grupos experimentais. Foi indicada terapia anti-inflamatória pré-cirúrgica (dexametasona 4 mg, dose única, 1 hora antes do procedimento) e analgésicos pós-operatórios (dipirona sódica 500 mg, de 4 em 4 horas, por 3 dias). Os pacientes foram orientados a tomar medicação analgésica somente em caso de dor no período descrito acima, sendo orientados a registrar a quantidade de medicamentos ingeridos. A terapia antimicrobiana sistêmica profilática foi realizada 1 hora antes dos procedimentos cirúrgicos com Amoxicilina 2 gramas e a mesma medicação será prescrita por 7 dias no pós-operatório, 500 mg a cada 8 horas.

As suturas foram removidas após 15 dias. No grupo ROG, a membrana foi retirada após o período de 28 dias, sob anestesia (Hoffmann et al. 2007, Carbonell et al. 2014, Cheon et al. 2017), sendo retirada delicadamente com o movimento de tração com auxílio de uma pinças.

Todos os pacientes foram acompanhados mensalmente, durante todo o período do estudo, para observar a manutenção periodontal e reforçar as instruções de higiene.

Colocação de Implantes e Próteses Três meses após a extração, independentemente do grupo experimental, os pacientes receberam implantes dentários. Assim, foram moldados para o planejamento da reabilitação e confeccionados guias cirúrgicos para serem utilizados na cirurgia de colocação dos implantes. No procedimento cirúrgico, os pacientes foram submetidos à anestesia local e foram confeccionados retalhos mucoperiosteais para acesso e exposição adequada do osso alveolar. Após, foi realizada a perfuração para inserção dos implantes. Em ambos os grupos foram realizados implantes de estágio único, com colocação imediata de próteses provisórias sobre implantes. Todas as cirurgias foram realizadas pelo mesmo operador (EKM).

Após a fase experimental do estudo, foram instaladas as próteses definitivas. As suturas dos procedimentos cirúrgicos foram feitas com fio de náilon 5.0 (Ethicon, Jonhson's Jonhson, São José dos Campos) e retirado após 7 dias. O controle do biofilme supragengival foi realizado com bochechos de clorexidina 0,12% por um período de 7 dias após a cirurgia. Foi indicada terapia anti-inflamatória pré-cirúrgica (dexametasona 4 mg, dose única, 1 hora antes do procedimento) e analgésicos pós-operatórios (dipirona sódica 500 mg, de 4 em 4 horas, por 2 dias).

Exame clínico O mesmo examinador (SB) realizou todas as medidas clínicas. Para realizar a calibração intra-examinador, foram escolhidos 15 indivíduos não incluídos no estudo que apresentavam implantes dentários. O examinador mediu a profundidade de sondagem peri-implantar de todos os indivíduos duas vezes em um período de 24 horas. A correlação intraclasse foi calculada como 95% de reprodutibilidade.

Usando uma sonda North Carolina/Colorvue (Hu-Friedy, Chicago, IL, EUA), os seguintes parâmetros foram medidos em quatro locais dos implantes dentários incluídos no estudo na linha de base (antes da extração e GBR) e em 3 meses de acompanhamento up: Profundidade de Sondagem (PPD/mm), que foi a distância do fundo do sulco/bolsa periodontal até a margem periodontal; Nível de inserção clínica (CAL/mm), que foi a distância da junção cimento-esmalte até o fundo da bolsa periodontal.

Avaliação do microbioma As avaliações microbiológicas do biofilme presente nas barreiras (grupo GBR) e na área de reparo (grupo não GBR) foram feitas após 3 dias da extração e após 28 dias (no momento da remoção da barreira no grupo GBR ).

A análise microbiológica será feita através da Técnica de Sequenciamento do gene 16S pela plataforma Illumina HiSeq, que permite determinar a diversidade e abundância da população microbiana em uma mesma amostra. Esta avaliação será realizada no Laboratório Multiusuário Centralizado de Genômica Funcional.

Avaliação dos parâmetros relatados pelo paciente A avaliação dos parâmetros centrados no paciente quanto aos sintomas relacionados à morbidade e à qualidade de vida no pós-operatório será realizada após 3, 7, 14, 28, 35 e 42 dias da extração, por meio de questionários , com base em uma linha horizontal de 100 mm (Visual Analog Scale; VAS).

Avaliação molecular de marcadores relacionados ao osteoclasto/blastogênese No procedimento cirúrgico de colocação de implantes dentários, durante a fresagem para preparo do leito, o tecido ósseo será removido utilizando um coletor ósseo descartável adaptado à bomba de vácuo/aspirador cirúrgico. Parte da amostra de tecido ósseo será utilizada para análise de expressão gênica e outra parte para análise imunoenzimática de diferentes biomarcadores relacionados a osteoclasto/blastogênese. Todas as análises moleculares relacionadas aos marcadores de osteoclasto/blastogênese serão realizadas no Laboratório de Pesquisa Odontológica da Instituição Sede. Todas as biópsias coletadas serão armazenadas em solução específica para evitar a degradação do RNA (RNAlater®, Ambion Inc., Austin, TX).

Análise de Expressão Gênica Extração de RNA: Os tecidos removidos serão devidamente embalados em uma solução para evitar a degradação do RNA (RNAlater®, Ambion Inc., Austin, TX). O RNA total será isolado pelo método reagente TRIZOL (Gibco BRL, Life Technologies, Rockville, MD, EUA). Primeiramente, a solução de RNAlater será aspirada e a amostra triturada será então colocada no reagente TRIZOL, agitada por 30 segundos e incubada por 5 minutos em temperatura ambiente. Após esse período, será adicionado clorofórmio (Sigma, St. Louis, MO, USA), agitado e centrifugado a 10.000 rpm por 15 minutos à temperatura de 4oC. A porção aquosa será transferida para outro tubo ao qual será adicionado o isopropanol, agitado, incubado por 20 minutos à temperatura de -20oC e centrifugado da mesma forma descrita acima. Após este processo, será formado um pellet, que será lavado com etanol 75% resfriado e seco à temperatura ambiente. As amostras de RNA serão ressuspensas em aproximadamente 50µl de água tratada com dietilpirocarbonato (DEPC) e armazenadas a -70oC. A concentração de RNA será determinada usando um espectrofotômetro.

Será realizado tratamento com DNAase e PCR em tempo real (RT-PCR).Primers para GAPDH (gene de referência), Fator de crescimento transformador (TGF-β), Sialoproteína óssea (BSP) e Colágeno tipo I (COL-I ) será projetado com o auxílio de um pGBRram desenvolvido especificamente para projetar primers para LightCycler (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha). Todos os primers serão verificados quanto à especificidade, verificando a curva de fusão usando controles positivos e negativos. O perfil da reação será determinado de acordo com a fórmula sugerida pelo fabricante do equipamento. Para cada uma das "corridas", será utilizada água como controle negativo, e o produto das reações será quantificado utilizando o próprio pGBRram (Software de quantificação relativa LightCycler - Roche Diagnostics GmbH) do próprio fabricante. O GAPDH será utilizado como gene de referência (housekeeping) para a normalização dos valores.

Análise imunoenzimática Parte da amostra de tecido ósseo coletada no momento da colocação do implante será colocada em tubos estéreis contendo 400μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) com 0,05% de Tween-20. Todas as amostras serão armazenadas a -20°C. Em seguida, o tecido será pesado, homogeneizado e dissolvido em PBS até uma concentração final de 100mg de tecido/mL. Após agitação em Vortex por 10 minutos, cada amostra será centrifugada a 370g por 5 minutos, o sobrenadante será coletado e armazenado a -70°C até o uso. Para evitar a atividade da protease, todo o procedimento será realizado a 4°C. Dickkopf (DKK1), Esclerostina (SOST), Fator de necrose tumoral (TNF-α), Osteoprotegerina (OPG), Osteocalcina (OC), Osteopontina (OPN) ( HBNMAG-51K, Millipore Corporation, Billerica, MA, EUA), receptor ativador de ligação NF-κB (RANKL) (HRNKLMAG-31K-01, Millipore Corporation, Billerica, MA, EUA), osteonectina (OSN) e fosfatase ácida resistente ao tartarato ( TRAP) (HCMBMAG-22K, Millipore Corporation, Billerica, MA, EUA), será determinado utilizando a tecnologia Luminex/MAGpix, que permite determinar a presença e quantificar de forma absoluta a concentração de diferentes marcadores na mesma amostra.

Para tanto, as análises serão realizadas em placas de 96 poços, com auxílio dos painéis de alta sensibilidade citados acima, seguindo as instruções do fabricante. As amostras serão avaliadas em duplicata e a média dos valores obtidos será utilizada para calcule as concentrações de cada marcador.

Análise tomográfica Tomografias computadorizadas dos pacientes serão obtidas imediatamente após a extração e 3 meses depois (antes da colocação do implante). Os exames tomográficos realizados nos diferentes períodos serão analisados ​​quanto à taxa de perda óssea após a extração e preservação do alvéolo, tanto na vertical quanto na horizontal, através do software Dental Slice.