Jednokomórkowe podejście do identyfikacji biomarkerów skuteczności i toksyczności dla ICI w NSCLC

Badacze pobiorą biopsje guza od 70 pacjentów z NSCLC st.IV przed rozpoczęciem leczenia inhibitorami immunologicznego punktu kontrolnego. Te biopsje są pobierane podczas wymaganej medycznie rutynowej procedury do celów diagnostycznych i będą poddawane następującym procedurom eksperymentalnym:

Najpierw scRNA-seq i TCR-seq zostaną zastosowane na maksymalnie 5000 losowo zdysocjowanych komórek. Dodatkowo ekspresję białek powierzchniowych komórki można zintegrować z informacją transkrypcyjną. Różne potoki bioinformatyczne, w tym Seurat, zostaną wykorzystane do identyfikacji różnych klastrów komórek, które poprzez ekspresję genów markerowych zostaną przypisane do znanych typów komórek, podtypów komórkowych lub fenotypów. Na przykład umożliwi to naukowcom monitorowanie obfitości komórek T wykazujących ekspresję PD-1/PD-L1, cytotoksycznych komórek T, immunosupresyjnych komórek mieloidalnych itp. Istotne będą następujące parametry na poziomie pojedynczej komórki (niewyczerpujący):

• Skład i względna obfitość ustalonych typów komórek odpornościowych (np. Komórki T (CD4+, CD8+ i podzbiory regulatorowe), komórki NK, komórki B, MDSC, makrofagi, neutrofile, komórki dendrytyczne). Dane transkryptomiczne dla każdego z tych podtypów komórek odpornościowych zostaną przeanalizowane, co pozwoli na scharakteryzowanie określonych programów ekspresji genów, które definiują określone stany fenotypowe.
• Skład wszystkich podtypów komórek zrębu zidentyfikowanych za pomocą transkryptomiki jednokomórkowej, w tym fibroblastów i komórek śródbłonka.
• Zostanie ustanowiona sieć regulacji genów dla każdego typu komórki i podtypu komórkowego (lub stanu komórki) oraz zostaną zidentyfikowane główne regulatory transkrypcji. Poszczególne komórki T i podgrupy komórek T zostaną sklasyfikowane na podstawie aktywacji interferonu, wysokich wskaźników proliferacji i transkrypcji oraz zwiększonej ekspresji granzymu, które wszystkie wskazują na aktywację komórek T. Ponieważ wysoka aktywność limfocytów T CD8+ koreluje z wysoką ekspresją immunologicznego punktu kontrolnego, aktywność limfocytów T (oparta na ekspresji granzymu) będzie skorelowana z ekspresją innych genów w tych komórkach w celu zidentyfikowania współregulowanych receptorów, które prawdopodobnie reprezentują nowe cząsteczki punktu kontrolnego.

Próbki krwi zostaną poddane podobnym procedurom eksperymentalnym. Najpierw izolowano PBMC stosując wirowanie w gradiencie gęstości Ficoll. Analiza transkryptomu pojedynczej komórki w połączeniu z CITE-seq zostanie przeprowadzona na 5000 PBMC. Skład komórkowy zostanie określony przy użyciu tych samych rurociągów bioinformatycznych, które zastosowano do przetwarzania biopsji guza.

Jako drugi cel, profilowanie immunologiczne składu komórkowego płynu ICI-pneumonitis BAL i PBMC zostanie przeprowadzone przy użyciu scRNA-seq, scTCR-seq i CITE-seq, jak opisano wcześniej.