Ein Einzelzellansatz zur Identifizierung von Biomarkern für Wirksamkeit und Toxizität für ICI bei NSCLC

Die Forscher werden vor Beginn der Behandlung mit Immun-Checkpoint-Inhibitoren Tumorbiopsien von 70 st.IV NSCLC-Patienten sammeln. Diese Biopsien werden im Rahmen eines medizinisch notwendigen Routineverfahrens zu diagnostischen Zwecken entnommen und folgenden experimentellen Verfahren unterzogen:

Zunächst werden scRNA-seq und TCR-seq auf bis zu 5.000 zufällig dissoziierte Zellen angewendet. Zusätzlich kann die Zelloberflächenproteinexpression mit der Transkriptionsinformation integriert werden. Verschiedene Bioinformatik-Pipelines, darunter Seurat, werden verwendet, um verschiedene Zellcluster zu identifizieren, die durch Markergenexpression bekannten Zelltypen, zellulären Subtypen oder Phänotypen zugeordnet werden. Dies wird es den Forschern beispielsweise ermöglichen, die Häufigkeit von PD-1/PD-L1-exprimierenden T-Zellen, zytotoxischen T-Zellen, immunsuppressiven myeloischen Zellen usw. zu überwachen. Die folgenden Parameter auf Einzelzellebene sind relevant (nicht erschöpfend):

• Die Zusammensetzung und relative Häufigkeit etablierter Immunzelltypen (z. T-Zellen (CD4+, CD8+ und regulatorische Untergruppen), NK-Zellen, B-Zellen, MDSCs, Makrophagen, Neutrophile, dendritische Zellen). Transkriptomische Daten für jeden dieser Immunzell-Subtypen werden analysiert, was die Charakterisierung spezifischer Genexpressionsprogramme ermöglicht, die spezifische phänotypische Zustände definieren.
• Zusammensetzung aller stromalen zellulären Subtypen, die durch Einzelzell-Transkriptomik identifiziert wurden, einschließlich Fibroblasten und Endothelzellen.
• Ein genregulatorisches Netzwerk für jeden Zelltyp und zellulären Subtyp (oder Zellzustand) wird etabliert und Master-Transkriptionsregulatoren werden identifiziert. Einzelne T-Zellen und T-Zell-Subcluster werden basierend auf Interferon-Aktivierung, hohen Proliferations- und Transkriptionsraten und erhöhter Granzym-Expression klassifiziert, die alle auf eine T-Zell-Aktivierung hinweisen. Da eine hohe CD8+-T-Zell-Aktivität mit einer hohen Immun-Checkpoint-Expression korreliert, wird die T-Zell-Aktivität (basierend auf Granzym-Expression) mit der Expression anderer Gene in diesen Zellen korreliert, um co-regulierte Rezeptoren zu identifizieren, die möglicherweise neue Checkpoint-Moleküle darstellen.

Blutproben werden ähnlichen experimentellen Verfahren unterzogen. Zuerst werden PBMC unter Verwendung von Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation isoliert. An 5000 PBMC wird eine Einzelzell-Transkriptomanalyse in Kombination mit CITE-seq durchgeführt. Die zelluläre Zusammensetzung wird unter Verwendung der gleichen bioinformatischen Pipelines bestimmt, die für die Verarbeitung der Tumorbiopsien verwendet werden.

Als zweites Ziel wird ein Immunprofil der zellulären Zusammensetzung von ICI-Pneumonitis-BAL-Flüssigkeit und PBMC unter Verwendung von scRNA-seq, scTCR-seq und CITE-seq wie zuvor beschrieben durchgeführt.