Uma abordagem de célula única para identificar biomarcadores de eficácia e toxicidade para ICI em NSCLC

Os investigadores coletarão biópsias de tumor de 70 pacientes com NSCLC st.IV antes do início do tratamento com inibidores de checkpoint imunológico. Essas biópsias são feitas durante um procedimento de rotina exigido por médicos para fins de diagnóstico e serão submetidas aos seguintes procedimentos experimentais:

Primeiro, scRNA-seq e TCR-seq serão aplicados em até 5.000 células dissociadas aleatoriamente. Além disso, a expressão da proteína da superfície celular pode ser integrada com a informação transcricional. Vários pipelines de bioinformática, incluindo Seurat, serão usados ​​para identificar diferentes clusters de células, que através da expressão de genes marcadores serão atribuídos a tipos de células conhecidas, subtipos celulares ou fenótipos. Por exemplo, isso permitirá que os pesquisadores monitorem a abundância de células T que expressam PD-1/PD-L1, células T citotóxicas, células mielóides imunossupressoras, etc. Os seguintes parâmetros no nível de célula única serão relevantes (não exaustivos):

• A composição e abundâncias relativas de tipos de células imunes estabelecidas (por exemplo, células T (CD4+, CD8+ e subconjuntos regulatórios), células NK, células B, MDSCs, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas). Dados transcriptômicos para cada um desses subtipos de células imunes serão analisados, permitindo a caracterização de programas específicos de expressão gênica que definem estados fenotípicos específicos.
• Composição de todos os subtipos celulares estromais identificados por transcriptômica unicelular, incluindo fibroblastos e células endoteliais.
• Uma rede reguladora de genes para cada tipo de célula e subtipo celular (ou estado celular) será estabelecida e os principais reguladores da transcrição serão identificados. Células T individuais e subgrupos de células T serão classificados com base na ativação do interferon, altas taxas de proliferação e transcrição e aumento da expressão de granzimas, que são todos indicativos de ativação de células T. Uma vez que a alta atividade das células T CD8+ se correlaciona com a alta expressão do checkpoint imunológico, a atividade das células T (com base na expressão da granzima) será correlacionada com a expressão de outros genes nessas células para identificar receptores co-regulados, que possivelmente representam novas moléculas do checkpoint.

As amostras de sangue serão submetidas a procedimentos experimentais semelhantes. Primeiro, as PBMC são isoladas usando centrifugação em gradiente de densidade Ficoll. A análise de transcriptoma de célula única em combinação com CITE-seq será realizada em 5000 PBMC. A composição celular será determinada usando os mesmos pipelines bioinformáticos usados ​​para processar as biópsias tumorais.

Como segundo objetivo, o perfil imunológico da composição celular do fluido ICI-pneumonite BAL e PBMC será realizado usando scRNA-seq, scTCR-seq e CITE-seq conforme descrito anteriormente.