Un approccio unicellulare per identificare i biomarcatori di efficacia e tossicità per l'ICI nel NSCLC

Gli investigatori raccoglieranno biopsie tumorali da 70 pazienti con NSCLC st.IV prima dell'inizio del trattamento con inibitori del checkpoint immunitario. Queste biopsie vengono prelevate durante una procedura di routine richiesta dal punto di vista medico per scopi diagnostici e saranno sottoposte alle seguenti procedure sperimentali:

Innanzitutto, scRNA-seq e TCR-seq verranno applicati su un massimo di 5.000 cellule dissociate casualmente. Inoltre, l'espressione della proteina di superficie cellulare può essere integrata con le informazioni trascrizionali. Varie pipeline bioinformatiche, tra cui Seurat, saranno utilizzate per identificare diversi cluster cellulari, che attraverso l'espressione di geni marcatori saranno assegnati a tipi cellulari noti, sottotipi cellulari o fenotipi. Ad esempio, ciò consentirà ai ricercatori di monitorare l'abbondanza di cellule T che esprimono PD-1/PD-L1, cellule T citotossiche, cellule mieloidi immunosoppressive, ecc. Saranno rilevanti (non esaustivi) i seguenti parametri a livello di singola cella:

• La composizione e la relativa abbondanza di tipi di cellule immunitarie consolidate (ad es. cellule T (CD4+, CD8+ e sottoinsiemi regolatori), cellule NK, cellule B, MDSC, macrofagi, neutrofili, cellule dendritiche). Saranno analizzati i dati trascrittomici per ciascuno di questi sottotipi di cellule immunitarie, consentendo la caratterizzazione di specifici programmi di espressione genica che definiscono specifici stati fenotipici.
• Composizione di tutti i sottotipi cellulari stromali identificati dalla trascrittomica unicellulare, inclusi fibroblasti e cellule endoteliali.
• Verrà stabilita una rete di regolazione genica per ogni tipo cellulare e sottotipo cellulare (o stato cellulare) e verranno identificati i principali regolatori trascrizionali. I singoli linfociti T ei sottogruppi di linfociti T saranno classificati in base all'attivazione dell'interferone, agli alti tassi di proliferazione e trascrizione e all'aumentata espressione del granzima, che sono tutti indicatori dell'attivazione dei linfociti T. Poiché l'elevata attività delle cellule T CD8+ correla con l'elevata espressione del checkpoint immunitario, l'attività delle cellule T (basata sull'espressione del granzima) sarà correlata con l'espressione di altri geni in queste cellule per identificare i recettori co-regolati, che possibilmente rappresentano nuove molecole del checkpoint.

I campioni di sangue saranno sottoposti a procedure sperimentali simili. Innanzitutto, le PBMC vengono isolate mediante centrifugazione in gradiente di densità Ficoll. L'analisi del trascrittoma di singola cellula in combinazione con CITE-seq sarà eseguita su 5000 PBMC. La composizione cellulare sarà determinata utilizzando le stesse pipeline bioinformatiche utilizzate per processare le biopsie tumorali.

Come secondo obiettivo, la profilazione immunitaria della composizione cellulare del fluido BAL ICI-polmonite e PBMC sarà eseguita utilizzando scRNA-seq, scTCR-seq e CITE-seq come precedentemente delineato.