Jednobuněčný přístup k identifikaci biomarkerů účinnosti a toxicity pro ICI u NSCLC

Vyšetřovatelé odeberou biopsie nádoru od 70 pacientů s st.IV NSCLC před zahájením léčby inhibitory imunitního kontrolního bodu. Tyto biopsie se odebírají během lékařsky vyžadovaného rutinního postupu pro diagnostické účely a budou podrobeny následujícím experimentálním postupům:

Nejprve budou scRNA-seq a TCR-seq aplikovány až na 5000 náhodně disociovaných buněk. Kromě toho může být exprese proteinu buněčného povrchu integrována s transkripční informací. K identifikaci různých buněčných shluků, které budou prostřednictvím exprese markerového genu přiřazeny ke známým buněčným typům, buněčným subtypům nebo fenotypům, budou použity různé bioinformatické kanály, včetně Seuratu. Například to výzkumníkům umožní sledovat množství T buněk exprimujících PD-1/PD-L1, cytotoxických T-buněk, imunosupresivních myeloidních buněk atd. Následující parametry na úrovni jedné buňky budou relevantní (není vyčerpávající):

• Složení a relativní množství zavedených typů imunitních buněk (např. T buňky (CD4+, CD8+ a regulační podskupiny), NK buňky, B buňky, MDSC, makrofágy, neutrofily, dendritické buňky). Budou analyzována transkriptomická data pro každý z těchto subtypů imunitních buněk, což umožní charakterizaci specifických programů genové exprese, které definují specifické fenotypové stavy.
• Složení všech stromálních buněčných subtypů identifikovaných jednobuněčnou transkriptomikou, včetně fibroblastů a endoteliálních buněk.
• Bude vytvořena genová regulační síť pro každý buněčný typ a buněčný subtyp (nebo buněčný stav) a budou identifikovány hlavní transkripční regulátory. Jednotlivé T lymfocyty a podskupiny T lymfocytů budou klasifikovány na základě aktivace interferonu, vysoké rychlosti proliferace a transkripce a zvýšené exprese granzymu, které jsou všechny indikativní pro aktivaci T lymfocytů. Protože vysoká aktivita CD8+ T buněk koreluje s vysokou expresí imunitního kontrolního bodu, aktivita T buněk (založená na expresi granzymu) bude korelovat s expresí jiných genů v těchto buňkách, aby se identifikovaly koregulované receptory, které možná představují nové molekuly kontrolních bodů.

Vzorky krve budou podrobeny podobným experimentálním postupům. Nejprve se izolují PBMC pomocí centrifugace s hustotním gradientem Ficoll. Jednobuněčná transkriptomová analýza v kombinaci s CITE-seq bude provedena na 5000 PBMC. Buněčné složení bude stanoveno za použití stejných bioinformačních potrubí, jaké se používají pro zpracování biopsií nádoru.

Jako druhý cíl bude provedeno imunitní profilování buněčného složení tekutiny ICI-pneumonitis BAL a PBMC pomocí scRNA-seq, scTCR-seq a CITE-seq, jak bylo uvedeno výše.