Одноклеточный подход к идентификации биомаркеров эффективности и токсичности для ICI при НМРЛ

Исследователи соберут биоптаты опухолей у 70 пациентов с НМРЛ st.IV до начала лечения ингибиторами иммунных контрольных точек. Эти биопсии берутся во время обязательной с медицинской точки зрения рутинной процедуры в диагностических целях и будут подвергнуты следующим экспериментальным процедурам:

Во-первых, scRNA-seq и TCR-seq будут применены к 5000 случайно диссоциированным клеткам. Кроме того, экспрессия белков клеточной поверхности может быть интегрирована с транскрипционной информацией. Различные конвейеры биоинформатики, включая Seurat, будут использоваться для идентификации различных клеточных кластеров, которые посредством экспрессии маркерного гена будут отнесены к известным типам клеток, клеточным подтипам или фенотипам. Например, это позволит исследователям контролировать количество Т-клеток, экспрессирующих PD-1/PD-L1, цитотоксических Т-клеток, иммуносупрессивных миелоидных клеток и т. д. Следующие параметры на уровне одной ячейки будут иметь значение (неполный список):

• Состав и относительная распространенность установленных типов иммунных клеток (например, Т-клетки (CD4+, CD8+ и регуляторные субпопуляции), NK-клетки, В-клетки, MDSC, макрофаги, нейтрофилы, дендритные клетки). Транскриптомные данные для каждого из этих подтипов иммунных клеток будут проанализированы, что позволит охарактеризовать конкретные программы экспрессии генов, которые определяют конкретные фенотипические состояния.
• Состав всех стромальных клеточных подтипов, идентифицированных с помощью транскриптомики одиночных клеток, включая фибробласты и эндотелиальные клетки.
• Будет создана генная регуляторная сеть для каждого клеточного типа и клеточного подтипа (или состояния клетки), и будут идентифицированы основные регуляторы транскрипции. Отдельные Т-клетки и субкластеры Т-клеток будут классифицироваться на основе активации интерферона, высоких скоростей пролиферации и транскрипции и повышенной экспрессии гранзимов, которые все указывают на активацию Т-клеток. Поскольку высокая активность Т-клеток CD8+ коррелирует с высокой экспрессией иммунных контрольных точек, активность Т-клеток (на основе экспрессии гранзимов) будет коррелировать с экспрессией других генов в этих клетках для выявления корегулируемых рецепторов, которые, возможно, представляют собой новые молекулы контрольных точек.

Образцы крови будут подвергнуты аналогичным экспериментальным процедурам. Во-первых, РВМС выделяют с помощью центрифугирования в градиенте плотности фиколла. Анализ транскриптома отдельных клеток в сочетании с CITE-seq будет выполняться на 5000 PBMC. Клеточный состав будет определяться с использованием тех же биоинформационных конвейеров, что и для обработки биоптатов опухолей.

В качестве второй цели будет проведено иммунное профилирование клеточного состава жидкости БАЛ ICI-пневмонита и РВМС с использованием scRNA-seq, scTCR-seq и CITE-seq, как описано ранее.