A contribuição da glicólise induzida para a assinatura de compostos orgânicos voláteis exalados (VOCs) no câncer de pulmão

A contribuição da glicólise induzida para a assinatura de compostos orgânicos voláteis exalados (VOCs) no câncer de pulmão

Resumo:

O câncer de pulmão é famoso por suas taxas de mortalidade cruéis, pois é o câncer mais letal em homens e mulheres. Infelizmente, a maioria dos cânceres de pulmão são detectados e diagnosticados em um estágio muito avançado e isso complica as opções de tratamento. Portanto, há uma necessidade extrema e não atendida de desenvolver um método de triagem eficaz, altamente sensível, altamente específico e não invasivo. A solução para este problema pode ser encontrada nos compostos orgânicos voláteis (VOCs) que são moléculas orgânicas identificadas na respiração exalada. Esses VOCs diferem entre aqueles indivíduos que sofrem de câncer de pulmão e indivíduos saudáveis. Visto que o aumento da glicólise é um dos padrões característicos das malignidades, o objetivo deste estudo é determinar a contribuição da glicólise induzida para esses VOCs exalados. Portanto, este estudo irá comparar amostras de ar exalado em indivíduos que sofrem de câncer de pulmão antes e depois de um teste de desafio com glicose. Este estudo visa entender melhor os mecanismos envolvidos para identificar os VOCs diferenciadores. Isso pode ajudar no desenvolvimento dos meios diagnósticos tão necessários para a triagem do câncer de pulmão.

1. Introdução:

   O câncer de pulmão é o câncer letal da traça em homens e mulheres. [1] Existem duas classes principais de câncer de pulmão: a primeira, o câncer de pulmão de pequenas células (CPPC), que é frequentemente chamado de câncer de célula de aveia, e a segunda, o câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), que constitui a maioria dos casos de câncer de pulmão. [2] Infelizmente, a maior parte da detecção e diagnóstico do câncer de pulmão é realizada quando o câncer está em estágio metastático avançado, no qual a cirurgia não é uma opção de tratamento viável. [3] Assim, a detecção e o diagnóstico em seus estágios iniciais podem melhorar significativamente a taxa de sobrevida em cinco anos, bem como fornecer a possibilidade de cura.

   Ainda não foi desenvolvido um método eficaz e não invasivo de triagem de câncer de pulmão para distinguir marcadores biológicos encontrados em grupos de alto risco. Ultimamente, os pesquisadores começaram a considerar os modelos de compostos orgânicos voláteis (VOCs) como um possível meio de detecção precoce. Esses VOCs podem ser recuperados e isolados de amostras de ar exalado. Os VOCs refletem a atividade metabólica e bioquímica única nas células malignas. Essa associação foi comprovada em vários pesquisadores, bem como em nosso próprio grupo [4], que demonstrou que os VOCs não apenas podem distinguir entre indivíduos saudáveis ​​e afetados, mas também podem discernir entre SCLC e NSCLC. [5, 6] A pesquisa atual se concentrará na detecção, identificação e caracterização desses marcadores biológicos únicos encontrados no ar exalado daqueles que sofrem de câncer de pulmão. Entre os VOCs detectados, esta pesquisa se concentrará especificamente nos VOCs que têm potencial para serem incorporados a um método de triagem eficaz e não invasivo para o câncer de pulmão.

   A carcinogênese é um processo que está vinculado à evolução somática. Uma das vantagens evolutivas mais populares encontradas em células metastáticas malignas é o aumento da captação de glicose por meio do processo de glicólise. Esse processo de glicólise é exclusivo das células malignas porque é mais pronunciado em condições anaeróbicas, enquanto as células saudáveis ​​geralmente realizam a glicólise em condições aeróbicas. A glicólise anaeróbica - o processo de conversão de glicose em ácido láctico na presença de oxigênio - também é conhecida como "Efeito Warburg" em homenagem a Otto Warburg, que descobriu essa característica. [7]

   Assim, alguns dos processos distintivos encontrados nas células malignas são a taxa excedida de troca de substâncias e o aumento da degradação da glicose (Efeito Warburg). Esses processos liberam compostos orgânicos, alguns dos quais são liberados na respiração exalada. Portanto, esta pesquisa examinará a relação entre um teste de desafio com glicose e seu efeito no padrão de VOCs na respiração exalada.

2. Objetivos da Pesquisa:

   O modelo para partículas orgânicas na respiração exalada discrimina entre os indivíduos que sofrem de câncer de pulmão ativo daqueles indivíduos considerados saudáveis. O objetivo deste estudo é examinar a contribuição do processo de glicólise para este modelo único. Sendo o processo de glicólise acelerado nas células malignas, hipotetizamos que o teste de provocação com glicose expressará VOC naqueles indivíduos que sofrem da doença. Essas descobertas podem contribuir para o desenvolvimento de ferramentas de diagnóstico para câncer de pulmão.

3. Hipótese:

   Nossa hipótese é que o Efeito Warburg é um componente essencial na criação de VOCs exclusivos do câncer de pulmão e, portanto, que o teste de desafio com glicose aumentará a produção desses VOCs. Esses marcadores têm o potencial de criar um método de triagem não invasivo mais eficaz, com sensibilidade e especificidade aprimoradas.

4. Métodos:

4.1 Projeto de Pesquisa: Esta pesquisa é um estudo observacional de caso-controle avalia a comparação entre as amostras de VOCs obtidas a partir de amostras de ar exalado e exames de sangue feitos antes e depois de um teste de provocação de glicose. O teste de provocação de glicose envolve a ingestão de uma solução que contém 75 gramas de glicose e um período de espera de 90 minutos entre a coleta da respiração exalada e as amostras de sangue. Há uma necessidade de jejum de seis horas antes deste teste. Além disso, será realizada uma avaliação clínica com base na anamnese médica e nas informações médicas existentes e atuais.

4.2 População do estudo: O objetivo desta pesquisa é determinar se o processo de glicólise contribui para o padrão único de VOC na respiração exalada daqueles que são afetados com câncer de pulmão. Os participantes serão escolhidos entre indivíduos que estão sendo tratados em clínicas de pneumologia por vários motivos. O grupo de controle incluirá participantes que foram identificados como indivíduos de alto risco para câncer de pulmão, enquanto o grupo de estudo incluirá participantes que sofrem de câncer de pulmão ativo, mas ainda não iniciaram nenhuma forma de tratamento médico.

O processo seletivo será realizado em duas etapas consecutivas. Na primeira etapa, vinte pacientes do grupo de estudo serão comparados com os vinte participantes do grupo controle. Neste ponto, uma avaliação preliminar dos dados será realizada para encontrar diferenças nos VOCs entre esses dois grupos. Somente caso essas diferenças sejam encontradas, a pesquisa passará para a segunda etapa, na qual mais 30 participantes serão recrutados e testados para o grupo de estudo.

O grupo controle, conforme mencionado anteriormente, incluirá 20 participantes que não têm câncer de pulmão, mas são semelhantes ao grupo de pesquisa em termos de idade, sexo, histórico médico e histórico de tabagismo. Essa classificação será realizada com base nas pesquisas de autorrelato preenchidas pelos participantes.

Os critérios de exclusão para a população do estudo são os seguintes:

1. Pacientes desinteressados ​​em participar e/ou incapazes de assinar um termo de consentimento
2. Pacientes com câncer de pulmão que iniciaram o tratamento antes desta pesquisa
3. Pacientes que não conseguem concluir esta pesquisa e/ou as visitas de acompanhamento
4. Indivíduos que sofrem de diabetes

4.3 Variáveis ​​de pesquisa:

As principais variáveis ​​que serão usadas para testar nossa hipótese são as seguintes:

• Variáveis ​​epidemiológicas dos participantes
• Dados quantitativos que definem as células malignas ( TMN, tamanho do tumor, número de metástases e sua localização)
• Os níveis de glicose (através de uma vareta) antes e depois do teste de desafio de glicose (requer um jejum de 6 horas antes do teste)
• O padrão de VOCs obtido das amostras de ar exalado e a caracterização dessas moléculas pelo método GCMS.

4.4 Métodos de pesquisa:

Anamnese Médica:

Uma coleção de detalhes do histórico médico do paciente será obtida. Informações como sexo, idade, histórico médico, consumo de tabaco e histórico familiar serão anotadas. Além disso, informações que quantificam e qualificam as células malignas (se presentes) serão coletadas e registradas. Isso inclui detalhes como o tipo de tumor, bem como sua localização, volume, características histológicas e resultados de imagem. Algumas das informações médicas serão obtidas de registros médicos atualizados pré-existentes.

Teste de respiração expirada:

Cada participante será submetido a um teste de respiração exalada antes e após o teste de desafio de glicose com um período de repouso de 90 minutos entre os testes.

A explicação detalhada sobre o processo de coleta das amostras de ar exalado:

O paciente expirará 3 respirações (com 750 ml em cada expiração) em sacos Mylar apropriados em uma área estéril com tecnologia que garante que a respiração expirada seja isolada e não afetada do ambiente externo. O conteúdo dos sacos de Mylar será armazenado em amostras TENAX que preserva as amostras por um período de seis meses. As amostras serão submetidas a análises adicionais no Instituto de Tecnologia de Israel (Technion) sob os auspícios do professor Haim Hussam. Cada amostra será analisada para fins de identificação de VOCs pelo método GC-MS. A amostra passará por processamento adicional, como SPME (pré-concentração em microextração em fase sólida). O SPME será transferido para o GC-MS. O método GC-MS permite a identificação dos compostos em um curto período de tempo através do uso de instrumentos cromatográficos e espectroscópicos. O instrumento espectroscópico passará por análises adicionais por meio do instrumento AOS. O AOS inclui detectores que são conjugados com nanopartículas de ouro. Cada detector identifica uma ampla variedade de VOCs de acordo com sua localização e concentração, que causam níveis variados de resistência. Essa resposta é registrada e passará por análise estatística via PCA para focar nos padrões específicos de VOC encontrados na amostra.

A explicação detalhada do processo do teste de provocação de glicose é a seguinte:

É solicitado ao participante que beba uma solução açucarada (273 ml) constituída de 75 gramas de glicose e água. O teste exige que o participante jejue por um período de 6 horas antes do teste. Após beber a solução, o participante deve aguardar um período deitado de 90 minutos antes do reteste de sua respiração exalada. Além disso, o nível de glicose será testado por uma vareta antes de beber a solução e após o período de postura de 90 minutos.

4.5 Análise estatística: O tamanho da amostra é de 70 pessoas (40 pessoas na primeira etapa e 30 participantes adicionais na segunda etapa, conforme explicado acima).

A expectativa é que haja uma diferença significativa entre o modelo VOC antes e depois do teste de desafio com glicose. A diferença de efeito estimada é de cerca de 30%, assumindo que o erro amostral é de cerca de 10% e com um intervalo de confiança de 95%. O número de participantes necessários para alcançar resultados com significância estatística e efeito de tamanho varia de aproximadamente 20 a 25 pessoas.

As informações do AOS que registraram as alterações na resistência serão analisadas via PCA para focar nas alterações específicas do padrão VOC obtidas em cada amostra.

As demais variáveis ​​que foram medidas quantitativamente serão apresentadas em médias com seus respectivos desvios padrão. Aquelas variáveis ​​que foram obtidas quantitativamente serão apresentadas como porcentagens.

A análise estatística para significância será realizada pelos seguintes testes estatísticos: Teste T de Student, Qui-quadrado, Análise de Variância (ANOVA) e teste de Kruskal-Wallis. Todos os testes estatísticos serão realizados no programa de computador SPSS.