Microvesículas e monócitos para prever a mortalidade de pacientes com cirrose (PROMICE)

História natural da cirrose

A cirrose é a forma terminal da doença hepática crônica. Estima-se que 200.000 a 500.000 pessoas na França tenham cirrose. A cirrose é responsável por mais de 170.000 mortes por ano na Europa.

As principais causas de cirrose incluem o consumo excessivo de álcool, a principal causa na Europa, e as hepatites virais crônicas B e C, que são as principais causas na Ásia e na África. Além disso, a atual epidemia de obesidade e diabetes tipo 2 em todo o mundo levou a um aumento acentuado na incidência de esteato-hepatite não alcoólica associada à síndrome metabólica, particularmente na América do Norte.

A cirrose é definida histologicamente como uma alteração difusa na arquitetura do fígado por fibrose anular associada a nódulos de regeneração. Com o surgimento de testes não invasivos que permitem a medição da fibrose, a cirrose é agora considerada altamente provável quando a elasticidade do fígado medida pelo Fibroscan® é > 15 kPa.

Pacientes com cirrose podem ser perfeitamente assintomáticos e ter função hepática normal. Nesse caso, o escore de Child-Pugh, que classifica a gravidade da cirrose, é "A". No entanto, a gravidade da cirrose pode aumentar, resultando no desenvolvimento de sinais de insuficiência hepática, como icterícia, diminuição dos fatores de coagulação e hipoalbuminemia e/ou ascite ou encefalopatia hepática. A cirrose é então classificada como Child-Pugh B ou C.

A progressão da cirrose envolve vários processos: por um lado, um agravamento lento e contínuo associado à persistência da agressão hepática por um ou mais agentes causais (álcool e/ou síndrome metabólica e/ou vírus) e, por outro lado, rápida agravamento ocorrendo com complicações agudas da doença, como sangramento varicoso ou infecções bacterianas. De fato, a cirrose está associada a alterações importantes na imunidade inata que promovem infecções bacterianas graves, que podem levar à falência de órgãos. Tal complicação representa um ponto de inflexão na história natural da cirrose, uma vez que a transição de cirrose compensada para descompensada está associada a uma redução na sobrevida em 1 ano de 95 para 60%. Quando essas complicações estão associadas à falência de órgãos, a mortalidade a curto prazo aumenta drasticamente, com um terço dos pacientes morrendo em um mês. A associação da descompensação aguda da cirrose com uma ou mais falências de órgãos foi recentemente definida como uma nova síndrome denominada Insuficiência Hepática Aguda na Crônica (ACLF).

O único tratamento curativo para a cirrose é o transplante de fígado (TH). No entanto, a cada ano, entre 10 e 15% dos pacientes na lista de espera de transplante de fígado na França não conseguem o transplante e morrem prematuramente devido a uma complicação aguda da cirrose. Além disso, muitos pacientes morrem antes mesmo de serem colocados na lista de espera para transplante, como evidenciam os resultados de um recente estudo francês multicêntrico mostrando que a taxa de mortalidade em 6 meses para pacientes com cirrose descompensada, Child C, permanece igual a 25%. [8].

Predizer o resultado é, portanto, um grande desafio no tratamento de pacientes cirróticos.

Predição do resultado de pacientes com cirrose: escores clínicos.

Atualmente, a previsão do resultado de pacientes cirróticos é baseada no escore MELD (Model for End-Stage Liver Disease). O escore MELD inclui três critérios laboratoriais objetivos (INR, bilirrubina sérica e creatinina sérica). Foi estabelecido em 2000 em uma coorte americana para prever o risco de morte 3 meses após a colocação de TIPS (Transjugular Intrahepatic Portosystemic Shunt). Seu uso foi muito rapidamente estendido para a previsão de sobrevida de 3 meses de pacientes cirróticos em lista de espera para transplante. Desde 2007, na França, a alocação do enxerto é baseada no escore MELD, sendo os pacientes com o escore mais alto transplantados primeiro.

Desde então, o valor preditivo do MELD tem sido estudado em grandes coortes, mostrando que o desempenho do MELD em prever a morte é modesto, com áreas sob as curvas ROC (AUROC) variando de 0,64 a 0,72[3, 7, 19, 20]. Em 2014, 7 anos após a introdução do escore MELD, constatou-se que 11,5% dos pacientes em lista de espera para transplante de fígado ainda morriam antes de serem transplantados. Esses dados ilustram a necessidade de melhorar nossa capacidade de prever a morte de pacientes com cirrose avançada.

Nessa perspectiva, alguns autores tentaram melhorar o escore MELD adicionando uma ou mais variáveis, como o sódio sérico (MELD-Na=MELD-Na-[0,025×MELD× (140 - Na)] + 140). A contribuição desses escores MELD modificados não foi considerada suficiente para promover seu uso na prática clínica, deixando o objetivo de melhorar o MELD insatisfeito.

Predição do resultado de pacientes com cirrose: novos biomarcadores

Além dos escores clínicos, alguns biomarcadores parecem promissores. De fato, como parte da estreita colaboração entre os departamentos clínicos do Hospital Beaujon (Hepatologia e Anestesia-Reanimação) e as equipes Inserm (Dr E Weiss, Dr R Moreau, Inserm U1149, Centre de recherche sur l'inflammation, Paris) e PE Rautou, Dr. C Boulanger, Inserm U970; Centre de recherche cardiovasculaire, Paris), foram recentemente identificados dois tipos de biomarcadores que predizem a sobrevida de pacientes com cirrose.

As microvesículas são vesículas liberadas no meio extracelular durante a ativação celular ou apoptose, dois fenômenos fortemente envolvidos na cirrose. A equipe Inserm U970 (Pr PE Rautou, Dr. C Boulanger) mostrou em 2012 que as concentrações circulantes de microvesículas de hepatócitos aumentam com a gravidade da cirrose. Além disso, as microvesículas em pacientes com cirrose infantil B ou C promovem hipertensão portal por induzir hiporreatividade arterial a agentes vasoconstritores. Com base nesses resultados, um estudo prospectivo incluindo 242 pacientes com cirrose mostrou que as concentrações circulantes de microvesículas de hepatócitos são capazes de predizer a sobrevida em 6 meses de pacientes com cirrose independentemente do escore MELD.

A suscetibilidade dos pacientes cirróticos a infecções graves está relacionada a anormalidades em sua resposta imune inata e, principalmente, à ocorrência de uma resposta inflamatória excessiva, responsável pela falência de órgãos. Os interferons tipo 1 (IFN 1) são mediadores inflamatórios cujo impacto no prognóstico da sepse pode ser prejudicial. Para determinar se a atividade da via IFN tipo 1 estava envolvida na desregulação da resposta imune inata e na suscetibilidade à sepse de pacientes com cirrose, a equipe do Inserm U1149 mediu, usando PCR quantitativo em tempo real, uma assinatura gênica (escore IFN) refletindo a ativação desta via nas células imunológicas de 99 pacientes com cirrose descompensada internados no departamento de fígado do Beaujon Hospital. Os investigadores demonstraram assim que a pontuação do IFN é capaz de predizer o risco de morte de doentes cirróticos independentemente da pontuação MELD com AUROC igual a 0,79 (0,7 para MELD).

Deve-se notar que esses dois biomarcadores (microvesículas de hepatócitos e escore de IFN) refletem processos fisiopatológicos diferentes e complementares: as microvesículas de hepatócitos refletem lesão hepática persistente enquanto o escore de IFN reflete a resposta imune inata. De referir ainda que estes biomarcadores, protegidos por duas patentes internacionais (EP121528133.5 e EP2016/077129), podem ser medidos em sangue periférico através de técnicas simples e prontamente disponíveis (ELISA/filtração, qPCR).

hipóteses

Neste projeto, os pesquisadores levantam a hipótese de que a previsão de morte de pacientes com cirrose avançada (Child-Pugh B ou C) por um escore composto que combina concentrações circulantes de microvesículas de hepatócitos, escore IFN e escore MELD será melhor do que aquele avaliado usando o escore MELD sozinho.

Essa pontuação composta ajudará os médicos a julgar a emergência do transplante de fígado e, assim, refinar os critérios para a alocação de transplantes de fígado. Essa pontuação composta também pode identificar uma população de pacientes com risco particular de morte que deve ser submetida a vigilância aumentada enquanto aguarda o transplante de fígado. Por meio dessas duas abordagens (melhor priorização de pacientes para transplante de fígado e maior monitoramento de pacientes de alto risco), esse novo escore composto reduzirá a mortalidade em pacientes com cirrose aguardando transplante de fígado.

Finalmente, novas abordagens terapêuticas para melhorar a sobrevida de pacientes com cirrose grave aguardando transplante de fígado (por exemplo, reduzindo a ocorrência de complicações) são testadas regularmente. A pontuação composta que os pesquisadores propõem também pode ser usada como um "companheiro" para monitorar a eficácia desses novos tratamentos.

População

Pacientes com cirrose Child-Pugh B ou C (comprovada por biópsia hepática, por método não invasivo de quantificação de fibrose ou por uma combinação de sinais clínicos, biológicos e radiológicos, ver acima) serão incluídos durante um período de dois anos.

Os pacientes serão incluídos durante as consultas ambulatoriais de acompanhamento em hepatologia ou durante a hospitalização programada, por exemplo, para endoscopia digestiva para rastrear sinais de hipertensão portal ou para remoção de ascite. Eles estarão, portanto, em uma condição estável.

A presença de eventos agudos ou eventos que possam modificar o risco de morte ou transplante de fígado e/ou a resposta inflamatória ou liberação de microvesículas estarão entre os critérios de não inclusão (ver acima).

Medições de biomarcadores

Após o consentimento informado, quinze a vinte mililitros de sangue venoso periférico (3 tubos de EDTA e 3 tubos de citrato) serão coletados dos pacientes participantes do estudo

Para microvesículas de hepatócitos, os tubos citrados serão centrifugados duas vezes e então congelados a -80°C até a análise.

Para o escore de IFN, o sangue contido nos 3 tubos de EDTA será utilizado para isolar as Células Mononucleares do Sangue Periférico (PBMCs). As PBMCs serão lisadas para obter RNA que será armazenado a -80°C até que o escore de IFN seja medido.

Ao final do período de inclusão de 2 anos, medições de microvesículas de hepatócitos e pontuação de IFN serão realizadas para todos os pacientes durante um período de 1 ano. As concentrações plasmáticas das microvesículas de hepatócitos serão determinadas em plasma livre de plaquetas por ELISA/filtração. Para medir a pontuação de IFN, o RNA de PBMCs previamente isolados será primeiro transcrito reversa. Em seguida, a expressão de cinco mRNAs de interesse será medida para calcular o escore de IFN.

Endpoint primário

O endpoint primário é a área sob a curva ROC do escore composto incluindo MELD, concentração de microvesículas de hepatócitos e escore IFN para prever a incidência cumulativa de morte em 6 meses (considerando o transplante de fígado como um risco competitivo) em comparação com a área sob a curva ROC do escore MELD sozinho.

A medição do desfecho primário será realizada de acordo com as recomendações específicas para análise de sobrevida em pacientes com cirrose, utilizando uma análise de sobrevida que considera o transplante de fígado como um risco competitivo. Dados de pacientes que não faleceram ou não foram transplantados serão censurados ao final do seguimento ou na data da última notícia (se o paciente for perdido no seguimento) ou na data do término da participação (em no caso de cessação da participação). O período de acompanhamento será de um ano após a inclusão (máximo de 13 meses para pacientes transplantados no 12º mês após a inclusão). Uma visita de acompanhamento 6 e 12 meses após a inclusão será agendada. Os dados sobre possíveis óbitos ou transplantes serão obtidos durante esta visita, por meio de prontuários, ou por meio de ligações telefônicas aos pacientes ou seus familiares. Para os indivíduos perdidos no seguimento, serão feitas solicitações ao CépiDc para obter seu estado vital. Os dados relativos a possíveis transplantes serão obtidos através de um pedido de acesso à base de dados "Cristal" (https://www.sipg.sante.fr) desenvolvido pela Agence de la biomédecine.