Microvescicole e monociti per predire la mortalità dei pazienti con cirrosi (PROMICE)

Storia naturale della cirrosi

La cirrosi è la forma terminale della malattia epatica cronica. Si stima che in Francia da 200.000 a 500.000 persone soffrano di cirrosi. La cirrosi è responsabile di oltre 170.000 decessi all'anno in Europa.

Le principali cause di cirrosi includono il consumo eccessivo di alcol, la principale causa in Europa, e l'epatite virale cronica B e C, che sono le principali cause in Asia e Africa. Inoltre, l'attuale epidemia di obesità e diabete di tipo 2 in tutto il mondo ha portato a un forte aumento dell'incidenza della steatoepatite non alcolica associata alla sindrome metabolica, in particolare nel Nord America.

La cirrosi è definita istologicamente come un'alterazione diffusa nell'architettura del fegato da fibrosi anulare associata a noduli di rigenerazione. Con l'emergere di test non invasivi che consentono la misurazione della fibrosi, la cirrosi è ora considerata altamente probabile quando l'elasticità del fegato misurata da Fibroscan® è > 15 kPa.

I pazienti con cirrosi possono essere perfettamente asintomatici e avere una funzionalità epatica normale. In questo caso, il punteggio Child-Pugh, che valuta la gravità della cirrosi, è "A". Tuttavia, la gravità della cirrosi può aumentare, determinando lo sviluppo di segni di insufficienza epatica, come ittero, riduzione dei fattori della coagulazione e ipoalbuminemia e/o ascite o encefalopatia epatica. La cirrosi viene quindi classificata come Child-Pugh B o C.

La progressione della cirrosi comporta diversi processi: da un lato un lento e continuo peggioramento associato alla persistenza dell'aggressione epatica da parte di uno o più agenti causali (alcol e/o sindrome metabolica e/o virus) e dall'altro un rapido peggioramento che si verifica con complicanze acute della malattia come sanguinamento da varici o infezioni batteriche. Infatti, la cirrosi è associata a importanti alterazioni dell'immunità innata che promuovono gravi infezioni batteriche, che possono portare a insufficienza d'organo. Tale complicanza rappresenta un punto di svolta nella storia naturale della cirrosi poiché il passaggio dalla cirrosi compensata a quella scompensata si associa a una riduzione della sopravvivenza a 1 anno dal 95 al 60%. Quando queste complicanze sono associate a insufficienza d'organo, la mortalità a breve termine aumenta drasticamente con un terzo dei pazienti che muore entro un mese. L'associazione dello scompenso acuto della cirrosi con uno o più disfunzioni d'organo è stata recentemente definita come una nuova sindrome denominata insufficienza epatica acuta su cronica (ACLF).

L'unico trattamento curativo per la cirrosi è il trapianto di fegato (LT). Tuttavia, ogni anno, tra il 10 e il 15% dei pazienti in lista d'attesa francese per il trapianto di fegato non può accedere al trapianto e muore prematuramente per una complicazione acuta della cirrosi. Inoltre, molti pazienti muoiono prima ancora di essere inseriti nella lista d'attesa per il trapianto, come evidenziato dai risultati di un recente studio multicentrico francese che mostra che il tasso di mortalità a 6 mesi per i pazienti con cirrosi scompensata, Child C, rimane pari al 25% [8].

La previsione dell'esito è quindi una sfida importante nella gestione dei pazienti cirrotici.

Previsione dell'esito dei pazienti con cirrosi: punteggi clinici.

Attualmente, la previsione dell'esito dei pazienti cirrotici si basa sul punteggio MELD (Model for End-Stage Liver Disease). Il punteggio MELD comprende tre criteri oggettivi di laboratorio (INR, bilirubina sierica e creatinina sierica). È stato istituito nel 2000 in una coorte americana per prevedere il rischio di morte a 3 mesi dopo il posizionamento di TIPS (Transjugular Intrahepatic Portosystemic Shunt). Il suo utilizzo è stato rapidamente esteso alla previsione della sopravvivenza a 3 mesi dei pazienti cirrotici in lista d'attesa per il trapianto. Dal 2007, in Francia, l'assegnazione del trapianto si basa sul punteggio MELD, con i pazienti con il punteggio più alto che vengono trapiantati per primi.

Da quel momento, il valore predittivo di MELD è stato studiato in ampie coorti, dimostrando che le prestazioni di MELD nel predire la morte sono modeste, con aree sotto le curve ROC (AUROC) che vanno da 0,64 a 0,72 [3, 7, 19, 20]. Nel 2014, 7 anni dopo l'introduzione del punteggio MELD, è stato riscontrato che l'11,5% dei pazienti in lista d'attesa per il trapianto di fegato moriva ancora prima di poter essere trapiantato. Questi dati illustrano la necessità di migliorare la nostra capacità di prevedere la morte dei pazienti con cirrosi avanzata.

In questa prospettiva, alcuni autori hanno cercato di migliorare il punteggio MELD aggiungendo una o più variabili, come il sodio sierico (MELD-Na=MELD-Na-[0.025×MELD× (140 - Na)] + 140). Il contributo di questi punteggi MELD modificati non è stato considerato sufficiente per promuoverne l'uso nella pratica clinica, lasciando insoddisfatto l'obiettivo di migliorare la MELD.

Previsione dell'esito dei pazienti con cirrosi: nuovi biomarcatori

Oltre ai punteggi clinici, alcuni biomarcatori sembrano promettenti. Infatti, nell'ambito della stretta collaborazione tra i dipartimenti clinici dell'ospedale di Beaujon (Epatologia e Anestesia-Rianimazione) e le équipe Inserm (Dr E Weiss, Dr R Moreau, Inserm U1149, Centre de recherche sur l'inflammation, Parigi) e il Pr PE Rautou, Dr C Boulanger, Inserm U970 ; Centre de recherche cardiovasculaire, Parigi), sono stati recentemente identificati due tipi di biomarcatori che predicono la sopravvivenza dei pazienti con cirrosi.

Le microvescicole sono vescicole rilasciate nel mezzo extracellulare durante l'attivazione cellulare o l'apoptosi, due fenomeni fortemente coinvolti nella cirrosi. Il team Inserm U970 (Pr PE Rautou, Dr C Boulanger) ha mostrato nel 2012 che le concentrazioni circolanti di microvescicole di epatociti aumentano con la gravità della cirrosi. Inoltre, le microvescicole nei pazienti con cirrosi infantile B o C promuovono l'ipertensione portale inducendo iporeattività arteriosa agli agenti vasocostrittori. Sulla base di questi risultati, uno studio prospettico comprendente 242 pazienti con cirrosi ha dimostrato che le concentrazioni circolanti di microvescicole epatocitarie sono in grado di predire la sopravvivenza a 6 mesi dei pazienti con cirrosi indipendentemente dal punteggio MELD.

La suscettibilità dei pazienti cirrotici alle infezioni gravi è correlata ad anomalie nella loro risposta immunitaria innata e in particolare al verificarsi di un'eccessiva risposta infiammatoria, responsabile dell'insufficienza d'organo. Gli interferoni di tipo 1 (IFN 1) sono mediatori dell'infiammazione il cui impatto sulla prognosi della sepsi potrebbe essere dannoso. Per determinare se l'attività del pathway dell'IFN di tipo 1 fosse coinvolta nella deregolazione della risposta immunitaria innata e nella suscettibilità alla sepsi dei pazienti con cirrosi, il team di Inserm U1149 ha misurato, utilizzando la PCR quantitativa in tempo reale, una firma genica (punteggio IFN) che riflette l'attivazione di questo percorso nelle cellule immunitarie di 99 pazienti con cirrosi scompensata ricoverati presso il dipartimento di fegato del Beaujon Hospital. I ricercatori hanno così dimostrato che il punteggio IFN è in grado di predire il rischio di morte dei pazienti cirrotici indipendentemente dal punteggio MELD con AUROC pari a 0,79 (0,7 per MELD).

Va notato che questi due biomarcatori (microvescicole degli epatociti e punteggio IFN) riflettono processi fisiopatologici diversi e complementari: le microvescicole degli epatociti riflettono un danno epatico persistente mentre il punteggio IFN riflette la risposta immunitaria innata. Va inoltre notato che questi biomarcatori, protetti da due brevetti internazionali (EP121528133.5 e EP2016/077129) possono essere misurati su sangue periferico utilizzando tecniche semplici e facilmente reperibili (ELISA/filtrazione, qPCR).

Ipotesi

In questo progetto, i ricercatori ipotizzano che la previsione della morte di pazienti con cirrosi avanzata (Child-Pugh B o C) mediante un punteggio composito che combina le concentrazioni circolanti di microvescicole di epatociti, il punteggio IFN e il punteggio MELD sarà migliore di quella valutata utilizzando il punteggio MELD da solo.

Questo punteggio composito aiuterà i medici a giudicare l'emergenza del trapianto di fegato e quindi a perfezionare i criteri per l'assegnazione dei trapianti di fegato. Questo punteggio composito può anche identificare una popolazione di pazienti a particolare rischio di morte che dovrebbe essere sottoposta a una maggiore sorveglianza in attesa del trapianto di fegato. Attraverso questi due approcci (una migliore definizione delle priorità dei pazienti per il trapianto di fegato e un maggiore monitoraggio dei pazienti ad alto rischio), questo nuovo punteggio composito ridurrà la mortalità nei pazienti con cirrosi in attesa di trapianto di fegato.

Infine, vengono regolarmente testati nuovi approcci terapeutici per migliorare la sopravvivenza dei pazienti con cirrosi grave in attesa di trapianto di fegato (ad esempio riducendo l'insorgenza di complicanze). Il punteggio composito proposto dai ricercatori potrebbe anche essere utilizzato come "compagno" per monitorare l'efficacia di questi nuovi trattamenti.

Popolazione

I pazienti con cirrosi di Child-Pugh B o C (provata da biopsia epatica, da metodo non invasivo di quantificazione della fibrosi o da una combinazione di segni clinici, biologici e radiologici, vedi sopra) saranno inclusi durante un periodo di due anni.

I pazienti saranno inclusi durante le visite ambulatoriali di follow-up in epatologia o durante il ricovero programmato, ad esempio per l'endoscopia digestiva per lo screening dei segni di ipertensione portale o per la rimozione dell'ascite. Saranno quindi in condizioni stabili.

La presenza di eventi acuti o eventi che possono modificare il rischio di morte o trapianto di fegato e/o la risposta infiammatoria o il rilascio di microvescicole saranno tra i criteri di non inclusione (vedi sopra).

Misure di biomarcatori

Dopo il consenso informato, verranno raccolti da quindici a venti millilitri di sangue venoso periferico (3 provette con EDTA e 3 provette con citrato) dai pazienti che partecipano allo studio

Per le microvescicole di epatociti, le provette citrate saranno centrifugate due volte e poi congelate a -80°C fino all'analisi.

Per il punteggio IFN, il sangue contenuto nelle 3 provette con EDTA verrà utilizzato per isolare le cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC). Le PBMC saranno lisate per ottenere l'RNA che sarà conservato a -80°C fino alla misurazione del punteggio IFN.

Alla fine del periodo di inclusione di 2 anni, verranno eseguite misurazioni delle microvescicole degli epatociti e del punteggio IFN per tutti i pazienti durante un periodo di 1 anno. Le concentrazioni plasmatiche delle microvescicole di epatociti saranno determinate su plasma privo di piastrine mediante ELISA/filtrazione. Per misurare il punteggio IFN, l'RNA da PBMC precedentemente isolati verrà prima trascritto inverso. Quindi, l'espressione di cinque mRNA di interesse sarà misurata per calcolare il punteggio IFN.

Punto finale primario

L'endpoint primario è l'area sotto la curva ROC del punteggio composito che comprende MELD, concentrazione di microvescicole epatocitarie e punteggio IFN per la previsione dell'incidenza cumulativa di morte a 6 mesi (considerando il trapianto di fegato come un rischio competitivo) rispetto all'area sotto la curva ROC del solo punteggio MELD.

La misurazione dell'endpoint primario sarà eseguita secondo le raccomandazioni specifiche per l'analisi di sopravvivenza nei pazienti con cirrosi, utilizzando un'analisi di sopravvivenza che consideri il trapianto di fegato come un rischio competitivo. I dati dei pazienti che non sono deceduti o non sono stati trapiantati saranno censurati alla fine del follow-up o alla data dell'ultima notizia (se il paziente è perso al follow-up) o alla data di cessazione della partecipazione (in caso di cessazione della partecipazione). Il periodo di follow-up sarà di un anno dopo l'inclusione (massimo 13 mesi per i pazienti che sono stati trapiantati nel 12° mese dopo l'inclusione). Sarà programmata una visita di follow-up 6 e 12 mesi dopo l'inclusione. I dati su possibili decessi o trapianti saranno ottenuti durante questa visita, utilizzando le cartelle cliniche o in seguito a telefonate ai pazienti o ai loro parenti. Per i soggetti persi al follow-up, verranno fatte richieste al CépiDc per ottenere il loro stato vitale. I dati relativi a possibili trapianti saranno ottenuti tramite una richiesta di accesso al database "Cristal" (https://www.sipg.sante.fr) sviluppato dall'Agence de la biomédecine.