Assinaturas do Microambiente Tecidual do Micetoma Granuloma

O micetoma é uma doença inflamatória crônica, específica, subcutânea, granulomatosa, progressiva e desfigurante. É causada por fungos verdadeiros ou por certas bactérias e, portanto, geralmente é classificada em eumicetoma e actinomicetoma, respectivamente. Madurella mycetomatis é o agente causador mais comum do eumicetoma, enquanto Streptomyces somaliensis e Nocardia brasiliensis são os organismos causadores comuns do actinomicetoma. A tríade de massa subcutânea indolor, formação de seios paranasais e secreção purulenta ou sero-purulenta contendo grãos é patognomônica de micetoma. O granuloma subcutâneo inflamatório geralmente se espalha para envolver a pele e as estruturas profundas, resultando em destruição, deformidade e perda de função, ocasionalmente pode ser fatal. O pé e a mão são os locais mais frequentemente afetados em 82% dos casos. Em áreas endêmicas, outras partes do corpo podem ser acometidas como joelho, braço, perna, cabeça e pescoço, coxa e períneo. Nenhuma idade é isenta no micetoma; no entanto, ocorre mais frequentemente em homens adultos jovens na faixa etária de 20 a 40 anos e quase 30% dos pacientes relatados eram jovens estudantes.

A verdadeira incidência e prevalência do micetoma em todo o mundo não é conhecida com precisão. É interessante notar que a maioria dos dados de micetoma relatados estão relacionados a pacientes hospitalares com doença avançada. Isso é atribuído à natureza do micetoma, que geralmente é indolor, lentamente progressivo e à apresentação tardia da maioria dos pacientes devido à má educação em saúde, falta de instalações de saúde e restrições financeiras.

A distribuição mundial do micetoma varia amplamente. É endêmica em muitas regiões tropicais e subtropicais e prevalece no cinturão de micetoma, que inclui os países do Sudão, Somália, Senegal, Índia, Iêmen, México, Venezuela, Colômbia, Argentina e alguns outros. O continente africano parece ter a maior carga e prevalência da doença. Também foi amplamente relatado na Índia. No entanto, o micetoma também foi relatado em muitas regiões temperadas. Existem alguns relatos sobre micetoma dos EUA, Sri Lanka, Alemanha, Egito, Turquia, Filipinas, Japão, Líbano, Tailândia, Arábia Saudita, Tunísia e Irã.

O tratamento adequado do micetoma depende principalmente de um diagnóstico preciso. É essencial identificar o organismo causador ao nível da espécie e os testes atuais para isso são a clássica cultura de grãos, biópsia cirúrgica, exame histopatológico e várias técnicas moleculares, como PCR. Várias técnicas de imagem, como radiologia convencional, ultrassonografia, tomografia computadorizada e ressonância magnética, estão em uso para determinar a extensão da doença. A maioria desses testes e técnicas são invasivas, caras e de baixa sensibilidade e especificidade. Além disso, eles não estão disponíveis nas regiões endêmicas de micetoma e, portanto, há uma necessidade desesperada de testes fáceis de usar e de campo para identificar o agente causador.

A gestão desta doença angustiante e devastadora é decepcionante. O tratamento depende principalmente do agente etiológico, da localização e extensão da doença. Até recentemente, o único tratamento disponível para o micetoma era a amputação ou múltiplas excisões cirúrgicas mutilantes e desfigurantes. O tratamento médico combinado na forma de antifúngicos para o eumicetoma e antibióticos e agentes antimicrobianos para o actinomicetoma e várias excisões cirúrgicas é o padrão-ouro no micetoma.

Relatos sobre tratamento médico em eumicetoma são escassos e inadequados. Ao longo dos anos e até agora, o tratamento do eumicetoma foi baseado na experiência clínica pessoal e nos resultados de relatos de casos esporádicos, em vez de ensaios clínicos controlados. Em geral, excisões cirúrgicas maciças ou amputação da parte afetada são o tratamento de escolha para o eumicetoma. Vários agentes antifúngicos foram tentados com pouco sucesso. Isso talvez seja surpreendente, pois os agentes causadores do eumicetoma são organismos infecciosos de baixo grau e sua erradicação deve ser prontamente alcançada pela administração de drogas antifúngicas. Geralmente, o actinomicetoma é passível de tratamento médico com antibióticos e outros agentes quimioterápicos. A terapia medicamentosa combinada é sempre preferida a um único medicamento para evitar a resistência aos medicamentos e para a erradicação da doença.

O tratamento médico para ambos os tipos de micetoma deve continuar até que o paciente esteja clinicamente, radiologicamente, ultrassonicamente e citologicamente curado. A recorrência é mais comum após um tratamento médico incompleto ou irregular. Com a não adesão do paciente, há uma boa chance de o organismo desenvolver resistência aos medicamentos.

O estudo foi conduzido na clínica Mycetoma no Mycetoma Research Center (MRC), Cartum, Sudão. Os pacientes foram incluídos no estudo após a obtenção do consentimento informado por escrito, de acordo com a Declaração de Helsinki.

Os pacientes foram categorizados em três grupos;

• Pacientes com lesões de eumicetoma (n=10)
• Pacientes com lesões de actinomicetoma (n=12)
• Pacientes com lesões de causalidade desconhecida (n=6)

A fixação em formalina e inclusão em parafina foi realizada no MRC de acordo com os procedimentos padrão.

Aspirados por agulha fina (FNA) foram coletados para citometria de fluxo ao mesmo tempo e no mesmo local da lesão no corpo.

Os aspirados foram congelados a -80C para análises futuras. Concomitantemente, 15 ml de sangue foram retirados de cada paciente para ensaios de função imunológica.

Células mononucleares de sangue periférico foram preparadas usando protocolos padrão e armazenadas em nitrogênio líquido até serem necessárias.

5 ml de sangue foram coletados em tubos Paxgene para análise transcriptômica.

Imuno-histoquímica A imuno-histoquímica foi realizada na Universidade de York, Reino Unido. As seções fixadas em formalina e embebidas em parafina (FFPE) foram analisadas usando o painel de perfilamento de célula imune PanCancer de 700 genes Nanostring para obter uma visão de alto nível da assinatura imune/inflamatória.

As seções em série foram submetidas a coloração de anticorpo altamente multiplexada usando o sistema Nanostring Digital Spatial Profiling para obter informações abrangentes e espacialmente resolvidas sobre o microambiente da lesão.

Alvos de pan-micetoma candidatos identificados por essas abordagens foram confirmados usando anticorpos imunofluorescentes e hibridização in situ fluorescente de RNA.

Todos os dados foram registrados como imagens de slides inteiras digitalizadas para publicação e arquivamento.

Respostas de células T específicas para antígenos A análise das respostas de células T foi realizada no Instituto de Doenças Endêmicas, Universidade de Khartoum.

Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de pacientes e controles saudáveis ​​pareados por idade e sexo de área endêmica foram estimuladas por 7 dias com fungos e lisados ​​bacterianos. As respostas de IFN, IL-17, IL-4 e IL-10 foram determinadas pelo ensaio ELISPOT.

A citometria de fluxo em FNBs foi realizada com painéis de anticorpos para avaliar células T e fenótipo de células mieloides.

Transcriptômica de sangue total O sangue foi coletado em Paxgene e armazenado a -80c. O RNA foi extraído de amostras armazenadas Os dados transcriptômicos completos de sangue total foram obtidos por RNA-Seq.

As medições de citocinas em aspirados de micetoma foram realizadas usando kits ELISA disponíveis comercialmente.