Firme del microambiente tissutale del granuloma del micetoma

Il micetoma è una malattia infiammatoria cronica, specifica, granulomatosa sottocutanea, progressiva e deturpante. È causato da veri funghi o da alcuni batteri e quindi è solitamente classificato rispettivamente in eumicetoma e actinomicetoma. Madurella mycetomatis è l'agente eziologico più comune dell'eumicetoma, mentre Streptomyces somaliensis e Nocardia brasiliensis sono gli organismi causativi comuni dell'actinomicetoma. La triade di una massa sottocutanea indolore, formazione di seni e secrezione purulenta o siero-purulenta che contiene granuli è patognomonica del micetoma. Il granuloma infiammatorio sottocutaneo di solito si diffonde per coinvolgere la pelle e le strutture profonde, con conseguente distruzione, deformità e perdita di funzione, occasionalmente può essere fatale. Il piede e la mano sono i siti più frequentemente colpiti osservati nell'82% dei casi. Nelle aree endemiche possono essere coinvolte altre parti del corpo come il ginocchio, il braccio, la gamba, la testa e il collo, la coscia e il perineo. Nessuna età è esentata nel micetoma; tuttavia, si verifica più frequentemente nei giovani uomini adulti nella fascia di età 20-40 anni e quasi il 30% dei pazienti segnalati erano giovani studenti.

La vera incidenza e prevalenza del micetoma in tutto il mondo non è nota con precisione. È interessante notare che la maggior parte dei dati riportati sul micetoma sono relativi a pazienti ospedalizzati con malattia avanzata. Ciò è attribuito alla natura del micetoma che è solitamente indolore, lentamente progressivo e alla presentazione tardiva della maggior parte dei pazienti a causa della scarsa educazione sanitaria, mancanza di strutture sanitarie e vincoli finanziari.

La distribuzione mondiale del micetoma varia notevolmente. È endemico in molte regioni tropicali e subtropicali e prevale nella fascia del micetoma, che comprende i paesi del Sudan, Somalia, Senegal, India, Yemen, Messico, Venezuela, Colombia, Argentina e pochi altri. Il continente africano sembra avere il carico e la prevalenza più elevati della malattia. È stato anche ampiamente segnalato dall'India. Tuttavia, il micetoma è stato segnalato anche in molte regioni temperate. Ci sono alcune segnalazioni di micetoma provenienti da Stati Uniti, Sri Lanka, Germania, Egitto, Turchia, Filippine, Giappone, Libano, Tailandia, Arabia Saudita, Tunisia e Iran.

Il corretto trattamento del micetoma dipende principalmente da una diagnosi accurata. È essenziale identificare l'organismo causale a livello di specie e gli attuali test per questo sono la classica coltura di grani, l'esame istopatologico della biopsia chirurgica e varie tecniche molecolari come la PCR. Varie tecniche di imaging come la radiologia convenzionale, l'ecografia, la TAC e la risonanza magnetica sono in uso per determinare l'estensione della malattia. La maggior parte di questi test e tecniche sono invasive, costose e di bassa sensibilità e specificità. Inoltre, non sono disponibili nelle regioni endemiche del micetoma e quindi c'è un disperato bisogno di test facili da usare e adatti al campo per identificare l'agente eziologico.

La gestione di questa malattia angosciante e devastante è deludente. Il trattamento dipende principalmente dall'agente eziologico, dalla sede e dall'estensione della malattia. Fino a poco tempo fa, l'unico trattamento disponibile per il micetoma era l'amputazione o più escissioni chirurgiche mutilanti e deturpanti. Il trattamento medico combinato sotto forma di antimicotici per l'eumicetoma e antibiotici e agenti antimicrobici per l'actinomicetoma e varie escissioni chirurgiche è il gold standard nel micetoma.

I rapporti sul trattamento medico nell'eumicetoma sono scarsi e inadeguati. Nel corso degli anni e fino ad oggi, il trattamento dell'eumicetoma si è basato sull'esperienza clinica personale e sui risultati di casi clinici sporadici, piuttosto che su studi clinici controllati. In generale, l'escissione chirurgica massiccia o l'amputazione della parte interessata è il trattamento di scelta per l'eumicetoma. Vari agenti antimicotici sono stati provati con scarso successo. Ciò è forse sorprendente, poiché gli agenti causali dell'eumicetoma sono organismi infettivi di basso grado e la loro eradicazione dovrebbe essere prontamente raggiunta mediante la somministrazione di farmaci antifungini. In generale, l'actinomicetoma è suscettibile di trattamento medico con antibiotici e altri agenti chemioterapici. La terapia farmacologica combinata è sempre preferita a un singolo farmaco per evitare la resistenza ai farmaci e per l'eradicazione della malattia.

Il trattamento medico per entrambi i tipi di micetoma deve continuare fino a quando il paziente non è guarito clinicamente, radiologicamente, ultrasonicamente e citologicamente. La recidiva è più comune dopo un ciclo di trattamento medico incompleto o irregolare. Con la non compliance del paziente, c'è una buona possibilità che l'organismo sviluppi resistenza ai farmaci.

Lo studio è stato condotto presso la clinica Mycetoma presso il Mycetoma Research Center (MRC), Khartoum Sudan. I pazienti sono stati arruolati nello studio dopo aver ottenuto il consenso informato scritto in linea con la Dichiarazione di Helsinki.

I pazienti sono stati classificati in tre gruppi;

• Pazienti con lesioni da eumicetoma (n=10)
• Pazienti con lesioni da actinomicetoma (n=12)
• Pazienti con lesioni di causalità sconosciuta (n=6)

La fissazione in formalina e l'inclusione in paraffina sono state eseguite presso l'MRC secondo le procedure standard.

Gli aspirati con ago sottile (FNA) sono stati raccolti per la citometria a flusso nello stesso momento e nella stessa posizione della lesione nel corpo.

Gli aspirati sono stati congelati a -80°C per future analisi. Contemporaneamente, da ciascun paziente sono stati prelevati 15 ml di sangue per i test di funzionalità immunologica.

Le cellule mononucleate del sangue periferico sono state preparate utilizzando protocolli standard e conservate in azoto liquido fino al momento del bisogno.

5 ml di sangue sono stati raccolti in provette Paxgene per l'analisi trascrittomica.

Immunoistochimica L'immunoistochimica è stata eseguita presso l'Università di York, nel Regno Unito. Le sezioni incorporate in paraffina fissata in formalina (FFPE) sono state analizzate utilizzando il pannello di profilazione delle cellule immunitarie PanCancer PanCancer a 700 geni per ottenere una visione di alto livello della firma immunitaria/infiammatoria.

Le sezioni seriali sono state sottoposte a colorazione anticorpale altamente multiplexata utilizzando il sistema di profilatura spaziale digitale Nanostring per ottenere una visione completa e risolta spazialmente del microambiente della lesione.

I bersagli pan-micetoma candidati identificati da questi approcci sono stati confermati utilizzando anticorpi immunofluorescenti e ibridazione in situ fluorescente con RNA.

Tutti i dati sono stati registrati come immagini di diapositive intere digitalizzate per la pubblicazione e l'archiviazione.

Risposte delle cellule T specifiche per l'antigene L'analisi delle risposte delle cellule T è stata eseguita presso l'Istituto per le malattie endemiche dell'Università di Khartoum.

Le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) di pazienti e un controllo sano corrispondente per età e sesso da un'area endemica sono state stimolate per 7 giorni con funghi e lisati batterici. Le risposte IFN, IL-17, IL-4 e IL-10 sono state determinate mediante saggio ELISPOT.

La citometria a flusso su FNB è stata eseguita con pannelli di anticorpi per valutare il fenotipo delle cellule T e delle cellule mieloidi.

Trascrittomica del sangue intero Il sangue è stato raccolto in Paxgene e conservato a -80°C. L'RNA è stato estratto dai campioni conservati I dati trascrittomici del sangue intero sono stati ottenuti mediante RNA-Seq.

Le misurazioni delle citochine negli aspirati del micetoma sono state effettuate utilizzando kit ELISA disponibili in commercio.