Vävnadsmikromiljösignaturer av mycetomgranulom

Mycetom är en kronisk, specifik, subkutan granulomatös, progressiv och vanprydande inflammatorisk sjukdom. Det orsakas av sanna svampar eller av vissa bakterier och därför klassificeras det vanligtvis i eumycetom respektive actinomycetoma. Madurella mycetomatis är det vanligaste orsakande eumycetomet, medan Streptomyces somaliensis och Nocardia brasiliensis är de vanligaste orsakerna till actinomycetom. Triaden av en smärtfri subkutan massa, bihålebildning och purulent eller sero-purulent flytning som innehåller korn är patognomonisk för mycetom. Det inflammatoriska subkutana granulomet sprider sig vanligtvis till att involvera huden och de djupa strukturerna, vilket resulterar i förstörelse, missbildning och funktionsförlust, ibland kan det vara dödligt. Foten och handen är de mest drabbade platserna som ses i 82 % av fallen. I endemiska områden kan andra delar av kroppen vara inblandade såsom knä, arm, ben, huvud och nacke, lår och perineum. Ingen ålder är undantagen vid mycetom; det förekommer dock oftare hos unga vuxna män i åldersintervallet 20-40 år och nästan 30 % av de rapporterade patienterna var unga studenter.

Den verkliga förekomsten och prevalensen av mycetom i hela världen är inte exakt känd. Det är intressant att notera att de flesta av de rapporterade mycetomdata är relaterade till sjukhuspatienter med avancerad sjukdom. Detta tillskrivs naturen av mycetom som vanligtvis är smärtfritt, långsamt progressivt och den sena presentationen av majoriteten av patienterna på grund av dålig hälsoutbildning, brist på hälsofaciliteter och ekonomiska begränsningar.

Den globala spridningen av mycetom varierar kraftigt. Det är endemiskt i många tropiska och subtropiska regioner och råder i mycetombältet, som inkluderar länderna Sudan, Somalia, Senegal, Indien, Jemen, Mexiko, Venezuela, Columbia, Argentina och några andra. Den afrikanska kontinenten verkar ha den högsta bördan och förekomsten av sjukdomen. Det har också rapporterats omfattande från Indien. Mycetom har dock rapporterats i många tempererade regioner också. Det finns några rapporter om mycetom från USA, Sri Lanka, Tyskland, Egypten, Turkiet, Filippinerna, Japan, Libanon, Thailand, Saudiarabien, Tunisien och Iran.

Den korrekta behandlingen av mycetom beror huvudsakligen på exakt diagnos. Det är viktigt att identifiera den orsakande organismen till artnivån och de aktuella testerna för det är den klassiska kornodlingen, kirurgisk biopsihistopatologisk undersökning och olika molekylära tekniker såsom PCR. Olika avbildningstekniker såsom konventionell radiologi, ultraljud, datortomografi och MRI används för att fastställa sjukdomsförlängningen. De flesta av dessa tester och tekniker är invasiva, dyra och av låg känslighet och specificitet. Dessutom är de inte tillgängliga i de endemiska mycetomregionerna och därför finns det ett desperat behov av lättanvända, fältvänliga test för att identifiera orsaksmedlet.

Hanteringen av denna plågsamma och förödande sjukdom är en besvikelse. Behandlingen beror huvudsakligen på det etiologiska medlet, platsen och omfattningen av sjukdomen. Fram till nyligen var den enda tillgängliga behandlingen för mycetom amputation eller flera stympande vanprydande kirurgiska excisioner. Kombinerad medicinsk behandling i form av svampdödande medel mot eumycetom och antibiotika och antimikrobiella medel mot aktinomycetom och olika kirurgiska excisioner är guldstandarden inom mycetom.

Rapporter om medicinsk behandling vid eumycetom är få och otillräckliga. Under åren och fram till nu baserades behandlingen av eumycetom på personlig klinisk erfarenhet och på resultaten av sporadiska fallrapporter snarare än på kontrollerade kliniska prövningar. I allmänhet är massiva kirurgiska excisioner eller amputation av den drabbade delen den bästa behandlingen för eumycetom. Olika svampdödande medel har prövats med liten framgång. Detta är kanske överraskande, eftersom de eumycetomorsakande medlen är låggradiga infektionsorganismer och deras utrotning bör lätt uppnås genom administrering av svampdödande läkemedel. I allmänhet är aktinomycetom mottagligt för medicinsk behandling med antibiotika och andra kemoterapeutiska medel. Kombinerad läkemedelsbehandling är alltid att föredra framför ett enda läkemedel för att undvika läkemedelsresistens och för att utrota sjukdomar.

Medicinsk behandling för båda typerna av mycetom måste fortsätta tills patienten är kliniskt, radiologiskt, ultraljuds- och cytologiskt botad. Återfall är vanligare efter en ofullständig eller oregelbunden medicinsk behandling. Med patientens bristande efterlevnad finns det en god chans för organismen att utveckla läkemedelsresistens.

Studien genomfördes på Mycetoma-kliniken vid Mycetoma Research Center (MRC), Khartoum Sudan. Patienter inkluderades i studien efter att skriftligt informerat samtycke erhållits i enlighet med Helsingforsdeklarationen.

Patienterna kategoriserades i tre grupper;

• Patienter med eumycetomlesioner (n=10)
• Patienter med aktinomycetomlesioner (n=12)
• Patienter med lesioner av okänd orsak (n=6)

Formalinfixering och paraffininbäddning utfördes vid MRC enligt standardprocedurer.

Finnålsaspirater (FNA) samlades in för flödescytometri vid samma tidpunkt och på samma plats för lesionen i kroppen.

Aspirat frystes vid -80C för framtida analys. Samtidigt togs 15 ml blod från varje patient för immunologiska funktionsanalyser.

Mononukleära celler från perifert blod preparerades med användning av standardprotokoll och lagrades i flytande kväve tills det krävdes.

5 ml blod samlades upp i Paxgene-rör för transkriptomisk analys.

Immunhistokemi Immunhistokemi utfördes vid University of York, Storbritannien. Formalinfixerade paraffininbäddade (FFPE) sektioner analyserades med hjälp av 700-gen Nanostring PanCancer Immune Cell-profileringspanelen för att erhålla en högnivåvy av immun/inflammatorisk signatur.

Seriella sektioner utsattes för starkt multiplexerad antikroppsfärgning med Nanostring Digital Spatial Profiling-systemet för att erhålla en omfattande och rumsligt lösta insikter i lesionsmikromiljö.

Kandidatmål för pan-mycetom som identifierats med dessa tillvägagångssätt bekräftades med hjälp av immunofluorescerande antikroppar och RNA-fluorescerande in situ hybridisering.

All data registrerades som digitaliserade hela diabilder för publicering och arkivering.

Antigenspecifika T-cellsvar Analys av T-cellers svar utfördes vid Institute for Endemic Diseases, University of Khartoum.

Perifera mononukleära blodceller (PBMC) från patienter och ålders- och könsmatchade frisk kontroll från endemiskt område stimulerades under 7 dagar med svamp och bakterielysat. IFN-, IL-17-, IL-4- och IL-10-svar bestämdes med ELISPOT-analys.

Flödescytometri på FNB utfördes med paneler av antikroppar för att utvärdera fenotyp av T-celler och myeloidceller.

Helblodstranskriptomik Blod samlades in i Paxgene och lagrades vid -80c. RNA extraherades från lagrade prover. Fullständiga transkriptomiska data för helblod erhölls med RNA-Seq.

Cytokinmätningar i mycetomaspirat utfördes med användning av kommersiellt tillgängliga ELISA-kit.