Sygnatury mikrośrodowiska tkankowego Mycetoma Granuloma

Mycetoma jest przewlekłą, specyficzną, podskórną ziarniniakową, postępującą i szpecącą chorobą zapalną. Jest to spowodowane przez prawdziwe grzyby lub niektóre bakterie, dlatego zwykle klasyfikuje się je odpowiednio jako eumycetoma i promieniowiec. Madurella mycetomatis jest najczęstszym czynnikiem wywołującym eumycetomę, podczas gdy Streptomyces somaliensis i Nocardia brasiliensis są powszechnymi organizmami sprawczymi promieniowca. Triada bezbolesnego guza podskórnego, powstawania zatok i wydzieliny ropnej lub surowiczo-ropnej zawierającej ziarna jest patognomoniczna dla grzybniaka. Zapalny ziarniniak podskórny zwykle rozprzestrzenia się, obejmując skórę i głębokie struktury, powodując zniszczenie, deformację i utratę funkcji, czasami może być śmiertelny. Stopa i dłoń są najczęściej dotkniętymi miejscami, które obserwuje się w 82% przypadków. Na obszarach endemicznych zajęte mogą być inne części ciała, takie jak kolano, ramię, noga, głowa i szyja, udo i krocze. Żaden wiek nie jest wyłączony w przypadku mycetoma; występuje jednak częściej u młodych dorosłych mężczyzn w wieku 20-40 lat, a prawie 30% zgłaszanych pacjentów stanowili młodzi studenci.

Prawdziwa częstość występowania i częstość występowania grzybniaka na świecie nie jest dokładnie znana. Warto zauważyć, że większość zgłoszonych danych dotyczących mycetom dotyczy pacjentów szpitalnych z zaawansowaną chorobą. Jest to związane z charakterem grzybniaka, który jest zwykle bezbolesny, wolno postępujący oraz późnym rozpoznaniem większości pacjentów z powodu słabej edukacji zdrowotnej, braku placówek służby zdrowia i ograniczeń finansowych.

Światowa dystrybucja mycetoma jest bardzo zróżnicowana. Występuje endemicznie w wielu regionach tropikalnych i subtropikalnych i przeważa w pasie mycetoma, który obejmuje kraje Sudanu, Somalii, Senegalu, Indii, Jemenu, Meksyku, Wenezueli, Kolumbii, Argentyny i kilku innych. Kontynent afrykański wydaje się mieć największe obciążenie i rozpowszechnienie choroby. Stwierdzono również obszernie zgłaszane z Indii. Jednak grzybniaka odnotowano również w wielu regionach o klimacie umiarkowanym. Istnieje kilka doniesień na temat mycetoma z USA, Sri Lanki, Niemiec, Egiptu, Turcji, Filipin, Japonii, Libanu, Tajlandii, Arabii Saudyjskiej, Tunezji i Iranu.

Właściwe leczenie grzybniaka zależy głównie od trafnej diagnozy. Niezbędne jest zidentyfikowanie organizmu sprawczego na poziomie gatunku, a obecne testy to klasyczna kultura ziarna, biopsja chirurgiczna, badanie histopatologiczne i różne techniki molekularne, takie jak PCR. Do określenia zasięgu choroby stosuje się różne techniki obrazowania, takie jak konwencjonalna radiologia, ultrasonografia, tomografia komputerowa i rezonans magnetyczny. Większość z tych testów i technik jest inwazyjna, kosztowna i ma niską czułość i specyficzność. Co więcej, nie są one dostępne w regionach endemicznych mycetoma i stąd istnieje desperacka potrzeba łatwego w użyciu, przyjaznego w terenie testu do identyfikacji czynnika sprawczego.

Leczenie tej niepokojącej i wyniszczającej choroby jest rozczarowujące. Leczenie zależy głównie od czynnika etiologicznego, umiejscowienia i zasięgu choroby. Do niedawna jedynym dostępnym sposobem leczenia grzybniaka była amputacja lub wielokrotne okaleczające i oszpecające wycięcia chirurgiczne. Skojarzone leczenie medyczne w postaci leków przeciwgrzybiczych na eumycetomę oraz antybiotyków i środków przeciwdrobnoustrojowych na promienica i różne wycięcia chirurgiczne jest złotym standardem w leczeniu mycetoma.

Doniesienia na temat leczenia eumycetoma są skąpe i niewystarczające. Na przestrzeni lat i do chwili obecnej leczenie eumycetomy opierało się raczej na osobistych doświadczeniach klinicznych i wynikach sporadycznych opisów przypadków niż na kontrolowanych badaniach klinicznych. Na ogół masowe wycięcie chirurgiczne lub amputacja dotkniętej części jest leczeniem z wyboru dla eumycetoma. Wypróbowano różne środki przeciwgrzybicze z niewielkim powodzeniem. Jest to być może zaskakujące, ponieważ czynniki sprawcze eumycetoma są organizmami zakaźnymi niskiego stopnia, a ich eradykacja powinna być łatwo osiągnięta przez podawanie leków przeciwgrzybiczych. Ogólnie rzecz biorąc, promieniowiec jest podatny na leczenie antybiotykami i innymi środkami chemioterapeutycznymi. Terapia skojarzona jest zawsze preferowana zamiast pojedynczego leku, aby uniknąć lekooporności i zwalczyć chorobę.

Leczenie farmakologiczne obu rodzajów grzybniaków musi być kontynuowane do czasu wyleczenia klinicznego, radiologicznego, ultrasonograficznego i cytologicznego pacjenta. Nawrót występuje częściej po niepełnym lub nieregularnym przebiegu leczenia. W przypadku nieprzestrzegania zaleceń przez pacjenta istnieje duże prawdopodobieństwo, że organizm rozwinie lekooporność.

Badanie przeprowadzono w klinice Mycetoma w Mycetoma Research Center (MRC) w Chartumie w Sudanie. Pacjenci zostali włączeni do badania po uzyskaniu pisemnej świadomej zgody zgodnie z Deklaracją Helsińską.

Pacjentów podzielono na trzy grupy;

• Pacjenci ze zmianami eumycetoma (n=10)
• Pacjenci ze zmianami promieniowca (n=12)
• Pacjenci ze zmianami o nieznanej przyczynowości (n=6)

Utrwalanie w formalinie i zatapianie w parafinie przeprowadzono w MRC zgodnie ze standardowymi procedurami.

Aspiraty cienkoigłowe (FNA) pobrano do cytometrii przepływowej w tym samym czasie iw tym samym miejscu zmiany w ciele.

Aspiraty zamrożono w temperaturze -80°C do przyszłej analizy. Jednocześnie od każdego pacjenta pobierano 15 ml krwi do testów funkcji immunologicznych.

Komórki jednojądrzaste krwi obwodowej przygotowano stosując standardowe protokoły i przechowywano w ciekłym azocie do czasu, gdy były potrzebne.

Do probówek Paxgene zebrano 5 ml krwi do analizy transkryptomicznej.

Immunohistochemia Immunohistochemia została przeprowadzona na University of York, UK. Skrawki utrwalone w formalinie zatopione w parafinie (FFPE) analizowano przy użyciu panelu profilowania 700 genów Nanostring PanCancer Immune Cell w celu uzyskania wysokiego poziomu obrazu sygnatury immunologicznej/zapalnej.

Seryjne skrawki poddano wysoce multipleksowanemu barwieniu przeciwciał przy użyciu systemu Nanostring Digital Spatial Profiling, aby uzyskać kompleksowy i przestrzennie rozdzielony wgląd w mikrośrodowisko zmian chorobowych.

Kandydackie cele pan-mycetoma zidentyfikowane za pomocą tych podejść zostały potwierdzone przy użyciu przeciwciał immunofluorescencyjnych i fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ z RNA.

Wszystkie dane zostały zapisane jako zdigitalizowane całe obrazy slajdów do publikacji i archiwizacji.

Odpowiedzi komórek T specyficzne dla antygenu Analizę odpowiedzi komórek T przeprowadzono w Instytucie Chorób Endemicznych Uniwersytetu w Chartumie.

Komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) od pacjentów oraz dopasowanej pod względem wieku i płci zdrowej kontroli z obszaru endemicznego stymulowano przez 7 dni lizatami grzybów i bakterii. Odpowiedzi IFN, IL-17, IL-4 i IL-10 określono w teście ELISPOT.

Cytometrię przepływową na FNB przeprowadzono z panelami przeciwciał w celu oceny fenotypu komórek T i komórek szpikowych.

Transkryptomiki krwi pełnej Krew pobrano do Paxgene i przechowywano w temperaturze -80°C. RNA ekstrahowano z przechowywanych próbek Pełne dane transkryptomiczne krwi pełnej uzyskano za pomocą RNA-Seq.

Pomiary cytokin w aspiratach grzybacza przeprowadzono przy użyciu dostępnych w handlu zestawów ELISA.