Papel dos microRNAs específicos na cefaleia em salvas (5*1000)

Antecedentes A cefaleia em salvas (CH) é uma cefaleia primária incluída nas cefaléias autonômicas do trigêmeo (TACs), de acordo com a Classificação Internacional de Transtorno de Cefaléia, Terceira Edição. O HC é caracterizado por uma fisiopatologia multifacetada e incompletamente compreendida. Acredita-se que o hipotálamo, o complexo vascular-trigêmeo e o reflexo autonômico trigêmeo desempenhem um papel significativo.

Evidências experimentais crescentes destacaram o envolvimento de microRNAs específicos (miRNAs) na dor crônica e nas dores de cabeça primárias, incluindo a enxaqueca. miRNAs são pequenos RNAs não codificantes endógenos com cerca de 22 nucleotídeos de comprimento. Os miRNAs operam como reguladores pós-transcricionais da expressão gênica, promovendo a degradação do RNA mensageiro (mRNA) ou reprimindo a tradução do mRNA. O processo de regulação realizado pelos miRNAs é complexo e articulado, uma vez que um miRNA individual pode ter como alvo centenas de mRNAs diferentes e, inversamente, cada mRNA pode ser regulado por múltiplos miRNAs. Estima-se que mais de 60% de todos os genes codificadores de proteínas são regulados por miRNAs que consequentemente determinam a modulação pleiotrópica de uma ampla variedade de processos celulares envolvendo diferenciação, desenvolvimento e sinalização. Os miRNAs estão envolvidos na geração e manutenção da dor e várias evidências sugerem que miRNAs específicos poderiam desempenhar um papel na enxaqueca.

Em um estudo recente, observamos uma regulação positiva da expressão gênica em dois miRNAs, miR-382-5p e miR-34a-5p, em células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) em indivíduos com enxaqueca crônica (MC). Esses miRNAs estão envolvidos na modulação da inflamação e na liberação de ácido γ-aminobutírico (GABA) em comparação com indivíduos com enxaqueca episódica e indivíduos saudáveis ​​(HCs). Esses achados ressaltam uma correlação entre a expressão gênica desses miRNAs e o fenótipo da enxaqueca, bem como sua gravidade.

Estudos recentes sugerem um papel ativo para certos neuropeptídeos no HC. O grupo dinamarquês demonstrou de facto que a administração intravenosa de CGRP, PACAP ou VIP pode induzir ataques agudos de HC em pelo menos 50% dos participantes quando estudados na fase activa da doença.

No momento, não há dados sobre o potencial envolvimento de miRNAs no CH. Este estudo tem como objetivo fornecer uma exploração detalhada do papel dos miRNAs na cefaleia em salvas, contribuindo para a nossa compreensão da fisiopatologia desta cefaleia primária. Além disso, os resultados obtidos podem abrir caminho para o desenvolvimento de uma nova geração de moléculas que poderão ser utilizadas na área de CH, como agonistas (Agomir) e antagonistas de miRNA (Antagomir).

Objetivos O objetivo principal do nosso projeto atual é investigar a expressão periférica de miRNAs implicados na modulação da dor (miR-382-5p, miR-34a-5p e miR-155) em indivíduos com HC episódico na fase ativa (eCH- act), HC episódico em fase de remissão (eCH-rem), HC crônico (cCH) e indivíduos controles saudáveis ​​(HC).

Métodos

Todos os sujeitos realizarão uma única avaliação ao longo do tempo durante a qual serão submetidos a:

• explicação dos procedimentos do estudo e assinatura do consentimento informado
• visita de triagem
• coleta de dados clínicos e demográficos (com base na revisão de um diário de dor de cabeça)
• amostragem de sangue venoso em jejum
• administração de questionários

Todos os sujeitos serão avaliados pela manhã, após jejum noturno. Para indivíduos afetados por cCH ou eCH-act, espera-se que a amostragem seja realizada na fase intercrítica, definida pela ausência de ataques de CH por pelo menos 3 horas em pacientes com eCH e por pelo menos 8 horas em pacientes com cCH. Após a coleta de sangue, os pacientes ficarão no Centro para preencher um conjunto de questionários. Isso permitirá ao investigador monitorar os pacientes por pelo menos 2 horas, para excluir que uma coleta de sangue seja realizada imediatamente antes de um ataque de CH.

Para pacientes com eCH, as fases “ativa” e “remissão” serão definidas da seguinte forma:

• Fase ativa: a fase durante a qual os ataques de CH estão presentes há pelo menos 7 dias.
• Fase de remissão: caracterizada pela ausência de crises de cefaleia em salvas por pelo menos 15 dias consecutivos sem terapia farmacológica.

A expressão dos genes miR-382-5p, miR-34a-5p e miRNA-155 será avaliada em PBMCs por transcrição reversa em tempo real (RT-PCR). Esta avaliação será normalizada com U6 (um tipo de pequeno RNA nuclear usado como gene doméstico) e expressa como Quantificação Relativa (RQ). Os níveis plasmáticos de CGRP alfa, PACAP e VIP serão medidos usando kits comerciais ELISA validados. Uma descrição detalhada dos métodos planejados para as análises bioquímicas pode ser encontrada aqui: https://doi.org/10.1186/s10194-020-01189-0.

O conjunto de questionários clínicos incluirá: Avaliação de incapacidade de enxaqueca (MIDAS), Teste de impacto de dor de cabeça (HIT-6), Questionário de impacto de dor de cabeça em salvas (CHIQ).

Cálculo do tamanho da amostra e análise estatística pré-planejada Foram considerados para o cálculo os seguintes parâmetros: Tamanho do Efeito: 0,5; erro alfa: 0,05; erro beta: 0,05 (poder: 95%); número de grupos: 4.

O cálculo do tamanho da amostra foi realizado utilizando a plataforma freeware G*Power (ver. 3.1.9.7) para teste ANOVA com correção de Bonferroni aplicado aos 4 grupos. O tamanho mínimo da amostra sugerido é de 76 sujeitos (19 sujeitos por grupo). Para levar em conta a variabilidade potencial, planejamos inscrever um total de 100 disciplinas, com 25 disciplinas por grupo.

Correlações paramétricas ou não paramétricas serão utilizadas para medir a relação entre variáveis ​​​​bioquímicas e variáveis ​​​​clínicas. As análises multivariadas serão realizadas de acordo com os resultados da análise univariada. A significância estatística será fixada no nível de 5% (p<0,05).